熟期调控
周晴 夏龙腾 罗飞雄 杨国顺 徐丰 王美军 许延帅
葡萄一年两收栽培技术是指一年生产两造（两茬、两季）葡萄的栽培模式。1959年，林守仁利用‘紫玫瑰香’上的冬芽生产二次果，这是我国较早有关二次果的报道。20世纪末的中国台湾，葡萄一年两次结果甚至多次结果技术已经成熟，并且实现商业价值。国内学者结合当地气候条件，根据两次果实生育期是否重合，探索出“两代同堂”与“两代不同堂”的新种植模式；根据果实生育期是否提前或者延后，探索出“促早栽培”和“延后栽培”的新种植模式。“延后栽培”是指去除一次花后，通过树体管理以及摘心修剪后枝梢管理，促使冬芽在当年萌芽并成花结果的一种栽培技术。大多数有研究认为：延后果在总糖含量、花青素含量、可溶性固形物、还原糖含量、固酸比等方面要优于一次果，同时在穗重、单粒重、单粒纵横经等方面却要显著低于一次果。陈爱军等人认为剪梢促花时期过早不利于提高‘夏黑’延后果还原糖含量以及可溶性固形物含量。[11,12]目前“延后栽培”、“一年两收”栽培技术已在湖南、浙江、广西、甘肃、天津等地慢慢应用。
鲜食葡萄的品质评价主要体现在外观品质以及内在品质。糖和酸是水果最重要的内在品质指标，也最直观的口感指标。糖不仅决定着葡萄果实的甜度和风味，而且影响着着色、香气物质以及特殊风味物质的形成果实中最主要的糖分包括蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、木糖、水苏糖、棉子糖等。成熟果实中糖组分最多的是果糖，其次是葡萄糖，两者比值接近1：1，蔗糖含量相对较少，但这三种糖占成熟果实中可溶性糖含量90%以上。不同糖组分之间的甜度都不同，当蔗糖甜度为1时，果糖的甜度是蔗糖的1.73倍，而葡萄糖仅是蔗糖的0.74倍。葡萄中有机酸含量很低，主要以酒石酸、苹果酸、柠檬酸为主，酒石酸虽涩但爽口；柠檬酸酸度快但持续时间短；苹果酸苦涩并释放缓慢，酸度的维持时间比柠檬酸长。在成熟的葡萄中，酒石酸和苹果酸占果实总酸的90%以上，2种酸在不同葡萄品种之间存在一定差异。
葡萄果实中蔗糖代谢相关的酶主要是蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和转化酶（INV）。SS具有双重活性（可逆反应），既能合成蔗糖（SSs）也能分解蔗糖（SSc）。SPS是催化蔗糖合成的关键酶。INV催化蔗糖水解产生果糖和葡萄糖为主的己糖（不可逆反应），根据PH环境的不同，又可以分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）。根据蔗糖来源与去向，可分为蔗糖合成酶类活性（SSs+SPS）以及蔗糖分解酶类活性（SSc+NI+AI）。
目前，延后栽培主要研究方向是栽培技术以及果实品质，但延后栽培果实中糖酸代谢相关的研究报道较少，特别是果糖与苹果酸的比值研究鲜有报道。本研究通过比较正常栽培和延后栽培两种不同的栽培模式下，‘夏黑’葡萄发育过程中果实果糖含量、葡萄糖含量、蔗糖含量；果糖与苹果酸的比值以及蔗糖代谢相关的酶变化，为‘夏黑’葡萄延后栽培果实风味品质提升提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试品种为9年生的‘夏黑’葡萄，于2012年定植于湖南农业大学（湖南长沙）干杉科研基地（N 28°8′21′′, E 113°11′54′′）。栽培模式：南北走向，起垄栽培（垄高0.5 m，垄宽2.0 m），树形为独龙干形，叶幕为“飞鸟”形，树干高度60 cm，株行距为2.8 m×1.8 m，钢架型简易小棚架避雨栽培，地面铺设两条滴灌带。
1.2 试验方法
1.2.1 试验树处理与采样
试验分两种处理：正常栽培（对照）和延后栽培（延后果）。选定的树体中庸、健康且一致，按照随机区组设计方式，每种各选相邻3株为1个重复，各设3次重复，共计18株。
正常栽培技术参照王华新[26]等，延后栽培技术参照白先进[27]等方法并作修改：2021年4月15日（花前3周）去除正常果实花序；当年生枝条长放，不做任何修剪处理。2021年4月30日，在主梢第6节位进行短截，除顶端夏芽副梢保留外，其他副梢全部修剪干净。待冬芽发育饱满后（10天后），去除顶端夏芽副梢，解除其对顶端冬芽的抑制，促使其萌芽并进行开花结果，后期栽培管理与正常栽培一致。
两个熟期的浆果分别从30 DAF（Days after flowering）起开始第一次采样，其余采样间隔为7天，采样时间分别是：30 DAF、37 DAF、44 DAF、51 DAF、58 DAF、65 DAF、72 DAF以及79 DAF。每个重复随机抽取果穗，每串分上、中、下三部各取2粒浆果，共计采样500 g浆果。一部分样品使用冰盒包裹并带回实验室，用于浆果体积、可溶性固形物、单粒重、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量的测定；另外一部分样品使用液氮速冻并带回实验室，存放于-80 ℃冰箱，用于AI、NI、SSc、SPS、SSs活性的测定。
1.2.2 体积的测定
将浆果充分混匀，从中随机挑选9粒，用数显卡尺测定，重复三次。浆果体积近似椭圆形，体积公式：V=4/3*Π*（H/2）*（R/2）²。式中：V为葡萄浆果体积（cm3）；H为葡萄浆果纵径（cm）；R为葡萄浆果横径（cm）。
1.2.3 可用性固形物和单粒重的测定
将浆果充分混匀，从中随机挑选9粒，用PAL-1糖度计测定，重复三次。
将浆果充分混匀，从中随机挑选10粒，用电子天平称量10粒浆果总重量后再除10得平均单粒重，重复三次。
1.2.4 果糖与苹果酸比值的计算
果糖/苹果酸=果糖含量/苹果酸含量。苹果酸、酒石酸和柠檬酸数据参照方海猛等结果。
1.2.5 单糖的测定
果糖、葡萄糖、蔗糖均采用高效液相色谱法，参照李佳秀[30]等人的试验方法并稍做修改如下：将浆果充分混匀，从中随机挑选100 g，在榨汁机里充分榨汁，用医用无菌纱布过滤得汁液，装试管备用。30 ℃下，将溶液超声20 min，后取1.0 mL的上清液于2 mL离心管内，在10000 r/min离心10 min；取上清液于0.22 um微孔滤膜过滤，待上机检测。Agilent 1260高效液相系统（Agilent公司，美国）；色谱柱：Agilent，ZORBAX Original 70Å 糖分析柱，4.6 x 250 mm，5 µm；流动相70%乙腈，1.0 mL/min，柱温40 ℃；进样量10 uL；RID 检测器 1260 RID，40 ℃。样品稀释2倍后上机测定。
1.2.6 酶活的测定
蔗糖代谢相关酶（AI、NI、SSc、SPS、SSs）活性均采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），试剂盒由诺敏科达（武汉）生物科技有限公司提供。
试验步骤：（1）随机挑选三粒葡萄果实，在液氮里充分研磨，装试管存-80 ℃冰箱备用。（2）称0.1 g样品于研钵中，加入1 ml提取液（五种酶用五种相应酶的提取液），冰浴匀浆后转入离心管中。12000 rpm，4 ℃离心10 min，取上清液。（3）后续操作按照各试剂盒说明书进行，使用紫外可见分光光度计（UVmlml-1280，岛津仪器有限公司）在450 nm波长下检测吸光度（OD值）。
1.3 数据处理
绘图使用软件Excel 2010，统计学显著性分析使用SPSS （v20.0）软件。
2 结果与分析
2.1 延后栽培对果实外观品质的影响
从外观上看，对照果实和延后果果实在44 DAF进入转色期。随着果实的发育成熟，对照果实的颜色逐渐由粉红转为黑紫色，延后果果实颜色一直为粉红色。完全成熟时，延后果果实着色明显比对照果实着色差，延后果果实表面的果粉同样差于对照果实（图1A）。
对照果实和延后果果实的单粒重在花后30-58天呈上升趋势，花后58天以后都趋于平缓，但各采样时期的单粒重始终是对照＞延后果，最终分别为8.2 g、3.64 g，且各采样时期均有显著性差异（图1B）。
对照果实和延后果果实的体积在花后30-58天呈上升趋势，花后58天以后都趋于平缓。对照的体积增长符合双“S”曲线模型，但延后果增长不符合该模型，呈线性模式。各采样时期的体积始终是对照＞延后果，最终分别为30.27（cm3）、11.33（cm3），且各采样时期均有显著性差异（图1C）。
2.2 延后栽培对可溶性固形物含量的影响
两者的可溶性固形物含量总体呈增长趋势。对照的始终随着果实生长发育而增长，延后果增长至花后65天时基本停滞。在花后58天以前，延后果的可溶性固形物含量始终高于对照，花后58天以后，两者含量相反。最终含量是对照（17.6）高于延后果（15.1）。除花后79天两者有显著性差异外，其余各采样时期无显著性差异（图2）。
2.3 延后栽培对果糖、葡萄糖、蔗糖含量的影响
果糖含量在整个果实发育期呈上升趋势。在花后44天以前增加缓慢；花后44-65天增加迅速，对照增长了160.32%，延后果增长了345.86%；花后72天以后略有下降，随后上升，最终对照是62.22 mg﹒mL-1，延后果是59.132 mg﹒mL-1。各采样时期无显著性差异（图3A）。
葡萄糖含量的变化趋势跟果糖含量的变化趋势相似，在花后44天以前增加缓慢；花后44-65天增加迅速，对照增长了127.35%，延后果增长了276.02%；花后72天以后略有下降，随后上升，最终对照是56.02 mg﹒mL-1，延后果是48.15 mg﹒mL-1。各采样时期无显著性差异（图3B）。
蔗糖含量在整个果实发育期呈缓慢上升趋势，变化相对平稳且含量极低。延后果的蔗糖含量在花后44天急剧上升，可能跟施肥以及果实无法膨大有关，造成单位体积内，蔗糖含量突高的局面。果实成熟采收期，对照的蔗糖含量为0.97 mg﹒mL-1，对照的蔗糖含量为0.86 mg﹒mL-1。各采样时期无显著性差异（图3C）。
2.4 延后栽培对成熟果实中糖酸百分比的影响
在果实成熟采收时，延后果与对照的三种糖所占百分比由高到低依次是果糖、葡萄糖、蔗糖，果糖与葡萄糖比值接近1，占据糖含量的99%以上，蔗糖含量不足1%。延后果中果糖所占百分比高于对照，葡萄糖和蔗糖所占百分比则是对照高于延后果。三种酸所占百分比由高到低依次都是酒石酸、苹果酸、柠檬酸。延后果与对照相比，酒石酸的百分比含量大幅度上升，柠檬酸和苹果酸的百分比含量则下降，但苹果酸下降幅度更大，从42.17%下降至21.90%。
2.5 延后栽培对果糖/苹果酸的影响
对照和延后果的果糖与苹果酸的比值随着果实的发育不断增高，在花后44天以前增长速度趋于平缓，花后44天以后增长速度加快。从花后65天以后，延后果的比值一直高于对照果的比值；成熟时，延后果与对照的比值分别为63.06、45.61，延后果比对照高了38.30%。花后65天以及花后79天两个时期，两者具有显著性差异，其余时期均无显著性差异。
2.6 延后栽培对酶活性的影响
2.6.1蔗糖分解方向酶活性的变化
蔗糖分解方向的酶包括酸性转化酶（AI）、中性转化酶（NI）以及蔗糖合成酶分解方向（SSc）。两个熟期的AI活性变动趋势基本相同，都成先下降后上升再下降的趋势；在花后51天时，两者活性都在最低值，对照为3812.75 U·g-1·h-1，延后果为4348.81 U·g-1·h-1；在花后65天时，两者活性都达到最高峰，分别为6564.48 U·g-1·h-1，延后果为6416.42 U·g-1·h-1（图5A）。
两个熟期的NI活性总体趋势呈上下式波动变化；对照的NI活性最高和最低分别出现在花后72天以及花后37天，分别是3589.53 U·g-1·h-1、4751.26 U·g-1·h-1。延后果的NI活性从花后30天到花后44天呈下降趋势，花后44天到花后65天呈上升趋势达到最高值——4726.75 U·g-1·h-1，在花后72天急剧下降至3648.23 U·g-1·h-1后在上升（图5B）。
对照的SSc活性先下降后上升再趋于平缓，在花后44天以及花后72天分别有最小活性及最大活性，分别为459.91 U·g-1·h-1、775.44 U·g-1·h-1。延后果的SSc活性）先下降后上升至最高活性——729.32 U·g-1·h-1，随后下降到花后65天时为最低活性——418.77 U·g-1·h-1，在花后72天急剧上升再下降。在花后51天以前，延后果的SSc活性始终高于对照的SSc活性，以后两者活性相反（图5C）。
2.6.2蔗糖合成方向酶活性的变化
两个熟期的SPS活性总体趋势呈上下式波动变化。对照的SPS活性先下降后上升再缓慢下降，在花后37天时活性最低——802.24 U·g-1·h-1，在花后44时活性最高——1153.35 U·g-1·h-1。延后果的SPS活性在花后58天前呈波动式上升，随后下降趋于平缓；在花后58天时活性最高——1074.76 U·g-1·h-1，在花后65天时活性最低——1074.76 U·g-1·h-1（图6A）。
对照的SSs活性在花后30-37天、花后51-58天以及花后72-79天呈上升趋势，其他时间则呈下降趋势；活性最高及活性最低分别出现在花后37天以及花后65天，分别为857.80 U·g-1·h-1、521.60 U·g-1·h-1。延后果的SSs活性上升、下降、上升再下降的动态趋势；活性最高及活性最低分别出现在花后51天以及花后65天，分别为835.49 U·g-1·h-1、595.08 U·g-1·h-1（图6B）。
3 讨论与结论
果实内糖的种类以及含量共同决定果实的甜味。延后果中果糖、葡萄糖和蔗糖这三种糖含量在绝大部时期均低于对照，特别是成熟时，延后果中还原性总糖（果糖+葡萄糖+蔗糖）含量任然低于对照。在花后58天以前，延后果的可溶性固形物高于对照，随后是对照高于延后果；直至果实成熟时，延后果的可溶性固形物同样低于对照。这与熊榆的延后果的还原性糖以及可溶性固形物要比正常栽培高的结论不一致。推测是因为修剪过早引起的，这与陈爱军在‘夏黑’延后果不同时间修剪实验中得出的结论一致。
果实内的可溶性糖和有机酸的含量及其比例共同决定果实甜酸风味。其中，果糖是最甜的糖组分，苹果酸苦涩、酸度维持时间长，因此，果糖与苹果酸的比值在一定程度上能反应果实的风味。葡萄果实成熟时，延后果果糖比率略高于对照，这与前人的研究成果一致。延后果的苹果酸比率远远低于对照。在花后65天之后，延后果的果糖与苹果酸比值高于对照，成熟时，延后果比对照高了38.30%，表明延后果的品质要比对照好。
延后果在着色、单粒重、体积等外在品质都显著低于一次果。葡萄的着色与花青素的密切相关，而花青素的形成又与温度和糖含量紧密相连。当白天的气温较高时（>33℃），花青素的积累将受到强烈的抑制。研究表明，果实着色与果实中糖含量间呈极显著正相关[38]。本研究中延后果的着色期正值湖南八月份，属于高温天气，同时延后果的糖（果糖+葡萄糖+蔗糖）含量均小于对照，这与前人研究的结果一致。延后果的单粒重不足对照的50%，体积大小也只有对照的37.43%，这与前人研究一致。研究表明高温不利于果实细胞分裂，导致细胞数量偏少。本研究的延后果生长季处于湖南七、八月份，对照生长季处于湖南六、七月份，因此延后果生长温度均高于对照，导致延后果中的细胞数量少于对照，进一步导致延后果的单粒重和体积明显小于对照。
葡萄果实糖含量的积累与蔗糖代谢相关酶密切相关。葡萄作为己糖积累型，对照与延后果两个熟期的蔗糖含量在整个生长发育期都很低，果糖与葡萄糖随着果实生长发育期逐渐上升，同时两个熟期的AI和NI活性在整个生长发育期都维持在较高水平，表明蔗糖源源不断分解成果糖与葡萄糖，这跟刘永忠等得出AI和NI起着降解蔗糖作用的结论一致。两个熟期的AI和NI活性，对照与延后果变化趋于一致，两者之间均无显著性差异。在花后51天以前，对照的SSc活性高于延后果；花后51天以后，延后果的SSc活性高于对照，表明延后果前期能促进SSc活性，中后期却抑制SSc活性，但两个熟期间酶活性均无显著性。延后果SSs活性在花后44、51、65、72天等时期高于对照，但两个熟期间酶活性均无显著性。不同品种的葡萄积累蔗糖能力不同，SSc和SSs活性也存在明显的差异性。闫梅玲等研究‘赤霞珠’葡萄果实发育中，发现SSs活性大于SSc活性，而在果实的发育过程中SSc活性则一直较低且变化较平稳。李梦鸽等研究‘美人指’葡萄果实发育过程中，发现SSc活性高于SSs活性，而SSs活性在果实整个发育期变化较平缓。本研究中SSc以及SSs活性相对趋于平缓且无显著性差异。本研究中蔗糖含量极低，各个时期的SPS活性比转化酶（AI+NI）活性都低，而SPS是合成蔗糖的关键酶，表明蔗糖合成能力较弱，研究结果与前人研究一致，两个熟期间酶活性均无显著性。
综上所述，延后果能提高成熟果实中果糖比率、降低成熟果实中苹果酸比率、提高果糖与苹果酸的比值，但在果实色泽、体积大小、单粒重、果糖含量、葡萄糖含量、蔗糖含量等方面提升不明显。延后果SSc的活性在花后30天至51天较高，花后51天以后较低，总体上对蔗糖代谢（AI、NI、SSc、SPS、SSs）五个酶的活性影响不大。