制汁葡萄品种改良岗位

刘镇东 林洪 姜长岳 郭修武 郭印山

  芪类（stilbenes）化合物是一类具有二苯乙烯为结构母核的化合物，是植物的应激产物，芪类化合物属于非黄酮类多酚物质，在植物的正常组织中含量很低，主要存在于植物木质部的薄壁细胞（斯建勇, 1994）。芪类物质的来源十分丰富，自1822年首次从蓼科植物大黄中分离出芪类化合物以来，已从23个科57属的植物中分离出芪类物质，如葡萄、花生、虎杖等（陈国良等, 2006）。按结构来分，芪类化合物主要分为两大类：单体芪和聚合芪（Shen et al., 2009）。目前，对单体芪的研究较多，例如白藜芦醇苷、白藜芦醇、紫檀芪等。芪类物质已经被证明具有抗癌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等功效（Baur, 2010）。葡萄已被证实是白藜芦醇含量较高的植物之一，山葡萄是葡萄属中白藜芦醇含量相对更高的种类，因此摸清山葡萄白藜芦醇遗传规律，筛选高含量白藜芦醇葡萄种质对今后葡萄品质育种及酿造高品质葡萄酒具有重要意义。

  本研究以‘红地球×双优’、‘霞多丽×北冰红’、‘赤霞珠×左优红’三个杂交群体后代及其亲本为试材，采用高效液相色谱法测定各试材白藜芦醇、葡萄素两种芪类物质的含量，并对其进行遗传分析，旨在揭示芪类物质的遗传趋势，并筛选出芪类物质高含量单株，研究结果可进一步丰富葡萄品质性状遗传理论，也为今后葡萄品质育种提供指导。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  ‘红地球×双优’杂交F1代共148株，‘霞多丽×北冰红’杂交F1代共53株，‘赤霞珠×左优红’杂交F1代共71株。试材均采自沈阳农业大学葡萄试验园。

  1.2 方法

  1.2.1 标准曲线的绘制

  准确称取白藜芦醇、白藜芦醇苷、葡萄素和紫檀芪标准样品3mg，用甲醇稀释并定容至10ml，配置成300mg/L母液，并逐级稀释成30mg/L、3mg/L、0.3mg/L、0.03mg/L的标准品溶液。将标准品溶液进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立线性回归方程并利用回归方程绘制标准曲线。

  1.2.2 果实处理及芪类物质的提取

  将葡萄果粒压碎，去除果肉及种子，用厨房纸将葡萄皮上残留的果肉擦除干净，液氮速冻后置-80℃超低温冰箱保存备用。提取时，称取1g果皮置于离心管中，用液氮研磨成粉末，加入10ml甲醇，摇匀。采用超声波辅助法提取，超声温度50℃，超声一小时。超声结束后10000rpm离心，取上清液，0.45μm有机滤膜过滤，-80℃冰箱避光保存待测。

  1.2.3 HPLC测定

  采用安捷伦1260型高效液相色谱仪，色谱柱采用安捷伦C18株（4.6mm×250mm，5μm），色谱条件采用国标方法，柱温45℃，检测波长306nm，进样量10μl，梯度洗脱程序见表1。

  1.2.4 数据分析

  采用Excel软件对原始数据进行整理，利用相关计算公式计算各组合变异系数、组合传递力、优势率、广义遗传力等遗传指标。变异系数、组合传递力、优势率等参数的计算公式如下。

  变异系数：CV/%=S/F×100（S：标准差 F：后代性状平均值）；

  遗传传递力：Ta/% = F/P × 100（F：后代性状平均值 P：亲中值）；

  优势率：Ha/% = （F– P）/P × 100（F：后代性状平均值 P：亲中值）；

  广义遗传力：H2 =[VH-1/2(VP1+VP2)]/VH×100％（VH为杂交群体的表现型方差，VP1为母本表现型方差，VP2为父本表现型方差）（陈学森等，2014）。

  2 结果与分析

  2.1 标准曲线的建立

  首先对四种芪类物质标准品进行单标检测，确定各组分出峰时间和紫外光谱图后，再对四种芪类物质标准品混标样品进行检测，得到白藜芦醇苷、白藜芦醇、紫檀芪、葡萄素的混标色谱峰图，其出峰时间分别为6.082 min、7.920min、8.737 min、13.720min。由图1可以看出，色谱图基线平稳，各标准物质峰形对称。

  对不同浓度的标准品溶液进行液相色谱分析，计算得到各标准品的标准曲线信息如表2所示。四种标准品标准曲线的相关系数均大于0.999，表明线性关系良好。

  2.2 遗传分析

  采用高效液相色谱法对各后代单株的芪类物质含量进行检测，图2为个别单株的色谱峰图。由图可以看出，白藜芦醇苷，白藜芦醇，葡萄素三种物质出峰时间与标准品大致相同，峰形对称，达到基线分离的效果，所有样品均在20 min内检测完毕。由于紫檀芪在所有供试样品中均未检测到，白藜芦醇苷仅在少数样品中检测到，故本研究只对白藜芦醇和葡萄素两种芪类物质进行遗传分析。

  确定了所有试材的白藜芦醇和葡萄素含量后，对其进行遗传分析。两种芪类物质在各群体中的频率分布如图3、4所示。由图3和4可以看出，白藜芦醇和葡萄素含量在三个杂交群体中均为连续分布，但其峰度值均大于3.5、峰度陡峭，偏度值均大于2.2（表3），表明两种物质含量在各后代群体中分布均较集中，呈现明显的偏态分布，且总体上偏向于低值亲本。这表明，虽然白藜芦醇和葡萄素含量在后代中连续分布，表现为数量遗传特点，但可能存在主效控制基因。

  表3所示为白藜芦醇及葡萄素含量在三个杂交群体中的遗传参数。从表中可以看出，无论是白藜芦醇还是葡萄素含量，其在各组合后代中的变异系数均大于78.33%，表明这两种物质含量在后代中变异幅度较大，分离广泛，表现出典型的数量遗传特点；此外，两种物质含量在各组合的广义遗传力均大于0.95，说明后代变异主要来自于遗传效应，受环境影响较小。

  对于超亲遗传指标，白藜芦醇含量在‘霞多丽×北冰红’、‘赤霞珠×左优红’两个群体中的子代平均值均大于亲中值，超高亲率也大于超低亲率，说明这两个组合中的白藜芦醇含量具有一定的杂种优势，具备筛选高白藜芦醇单株的潜力，这些特点与葡萄素含量在‘红地球×双优’、‘霞多丽×北冰红’两个群体中表现一致。‘红地球×双优’群体中白藜芦醇含量的优势率为负值，不表现杂种优势，这与葡萄素含量在‘赤霞珠×左优红’群体中表现一致。

  对于性状遗传传递力，葡萄素含量在各组合中大于212.8%，白藜芦醇含量在‘赤霞珠×左优红’组合中也高达143%，表明遗传能力强，能将性状稳定的传递到后代；而白藜芦醇含量在‘红地球×双优’、‘霞多丽×北冰红’两个群体中的遗传传递力较低，遗传能力相对较低。

  3 小结

  白藜芦醇和葡萄素含量在各组合后代中连续分布，表现为数量性状遗传特点，但在后代中的分布较集中，呈现明显的偏态分布，可能存在主效控制基因；两种物质含量在各组合的广义遗传力均大于0.95，说明后代变异主要来自于遗传效应，受环境影响较小；‘霞多丽×北冰红’、‘赤霞珠×左优红’两个群体的白藜芦醇含量以及‘红地球×双优’、‘霞多丽×北冰红’两个群体中的葡萄素含量，均表现为子代平均值均大于亲中值，超高亲率也大于超低亲率，具有一定的杂种优势，具备筛选高含量单株的潜力。