种木扩繁与生产技术岗位

王军

  摘要：本研究通过连续4年的实验（2017-2020）评估了三种砧木（1103P、SO4和5A）对‘赤霞珠’树势的生长及葡萄果实类黄酮物质的影响。结果表明，1103P增加了CS的修剪重量，减少了花色苷的含量。特别是在雨天和阴天较多的年份。5A有减少CS的修剪量，增加果实花色苷含量的趋势。正交部分最小二乘法判别分析（OPLS-DA）表明总花色苷、F3'H-花色苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（Mv-glu）和乙酰化的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（Mv-acglu）是CS中受砧木影响的关键物质。综上所述，建议在雨季和雨季时使用5A砧木

  关键词：‘赤霞珠’，砧木，类黄酮，OPLS-DA

  1  引言

  葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上最重要的水果之一，在不同的气候条件下都广泛种植。酿酒葡萄在生长季节降雨量少，日照多的气候条件下往往能达到最佳成熟度，如地中海气候。而雨水过多和光照不足的气候往往会限制葡萄的成熟度。在这种多雨和多云的地区，为了提高葡萄酒品质，应该采取适当的栽培措施促进葡萄成熟和类黄酮化合物的积累。砧木的使用是葡萄栽培中较为常用且具特色的农艺措施，最初的使用是源于根瘤蚜防治。一方面，砧木可以赋予接穗抗性，如抗盐碱、抗旱、抗涝和抗寒等特性，帮助葡萄在不利条件下生存。另一方面，砧木会影响接穗的表型，如树势、产量、浆果理化指标以及代谢产物等。许多研究表明，具有不同的砧木特性赋予接穗不同的表型特征。例如，具有高活力的砧木增加产量和修剪重量，以及果汁中的可滴定酸含量。在酿酒葡萄中，类黄酮化合物是重要的次级代谢产物，主要包括花色苷、黄酮醇和黄烷醇等，在对葡萄酒的颜色形成起着关键作用。一些研究发现，砧木影响浆果中类黄酮化合物的浓度。例如，Wang等研究表明5A、Harmony和Riparia Gloire可以增加‘赤霞珠’葡萄的黄酮醇浓度。SO4降低了大部分单体花色苷的浓度。另外有研究表明，Bouschet/1103P嫁接组合与自根苗相比，果实中的类类黄酮物质浓度较高。最近有研究表明，5BB有利于果皮中的原花色素的积累。尽管许多研究调查了砧木如何影响接穗品种的表现，但目前还不清楚在多雨少光的地区，特别是在浆果成熟期间有大量降雨的地区，砧木是否会对接穗果实类黄酮浓度产生影响。因此，我们在北京地区连续4年调查了3种砧木对‘赤霞珠’的树势生长、葡萄果实理化和葡萄类黄酮影响，为多雨少光地区砧木的选择使用提供参考。

  2 材料和方法

  2.1 实验材料和地点

  实验于2017-2020在中国农业大学上庄实验站进行（40°14′N，116°20′E，49m 海拔）。自生根CS为对照，分别嫁接在1103P，5A，SO4。植株于2012年种植的，2013年进行绿枝嫁接，行向为南北行向。行间距为2.5×1.2米。树形为M-VSP，每延米保留12-15个节间。每个砧穗组合有三个重复，每个重复包含15棵葡萄树。病虫害和营养控制措施是按照当地的行业标准实施。中国气象数据交换中心平台（http://cdc.cma.gov.cn/）提供了月平均温度、日照时间和降雨量在葡萄生长季节。此外，葡萄园的土壤被归类为 "沙质粘土"，含有9.35克/公斤有机物。

  2.2 葡萄树生长参数、浆果采样

  2018-2020年，叶面积、簇重、产量和修剪重的测定是根据Lu etal.(2022).不同发育阶段的夏季修剪重量（鲜重）（E-L 23, E-L 33, E-L 35.5, E-L 37）在2020年的生长季节被记录下来。在收获时，300个浆果被采样并确定其物理化学特性和类黄酮成分。

  2.3 浆果理化参数的测定

  在每个重复中，随机选择100个浆果进行称重，然后挤成葡萄汁。然后在8000×g离心5分钟，取上清液。使用便携式折射仪测定可溶性固形物含量。使用pH计来测定果汁的pH值。可滴定酸度的测定，使用0.05mol/L的NaOH进行滴定，酚酞作为指示剂，滴定终点pH值为8.2。可滴定酸以酒石酸当量（g/L）表示。

  2.4 类黄酮化合物的提取和测定

  每个生物学重复称取约80 g 冷冻的葡萄浆果，剥离果皮和种子，将果皮和种子立即用液氮速冻。然后将皮粉碎成粉末，在-40℃下进行冷冻干燥。黄酮醇和花色苷的提取按照进行Downey等人（2007）。黄烷醇提取的根据Liang等人的方法进行。花色苷测定用Cheng等开发的方法进行分析。安捷伦1100高效液相色谱-离子阱质谱配备Zorbax SB-C18 色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm）和二极管阵列检测器（Agilent，Santa Clara，CA，USA）用于葡萄果皮中花色苷的检测分析，仪器条件参照He 等人的方法。流动相A为甲酸：乙腈：水（2:6:92，v/v/v），流动相B 为甲酸：乙腈：水（2:54:44，v/v/v）。梯度洗脱程序为：0~4 min，6%~10% B；4~12 min，10%~25% B；12~13 min，25% B；13~20 min，25%~40% B；20~35 min，40%~60% B；35~40 min，60%~100% B；40~45 min，100%~6% B。流动相流速为1 mL/min，进样量为30 μL，柱温为50 °C，检测波长为525 nm。质谱参数如下：电喷雾离子源，正离子模式，雾化气为高纯氮气，雾化气温度为350 °C，雾化气压力为35 psi，干燥气流速为10 mL/min，离子扫描范围为100~1000 m/z。葡萄果皮的花色苷根据二甲花翠素3-O-葡萄糖苷的标准曲线进行相对定量，其浓度分别以mg/kg 鲜果重和μg/L 表示。安捷伦1200 液相色谱-离子阱质谱配备Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm）和可变波长检测器（Agilent，Santa Clara，CA，USA）用于葡萄果皮中黄酮醇的检测分析，仪器条件参照Sun 等的方法。流动相A 为乙腈：甲酸：水（5:10:85，v/v/v）溶液，流动相B 为乙腈：甲醇：甲酸：水（ 25:20:10:45 ， v/v/v/v ） 溶液。梯度洗脱程序为： 0~24.2 min， 0%~14.2% B；24.2~27 min ， 14.2%~15.7% B ； 27~33.4 min ， 15.7%~18.8% B ； 33.4~39 min ，18.8%~23.5% B；39~45 min，23.5%~26% B；45~47 min，26%~27.4% B；47~51.6min，27.4%~32% B；51.6~61.8 min，32%~40% B；61.8~67.8 min，40%~100% B；67.8~78.4 min，100%~0% B。流动相流速为0.63 mL/min，进样量为30 μL，柱温为40 °C，检测波长为360 nm。质谱参数如下：电喷雾离子源，负离子模式，雾化气为高纯氮气，雾化气温度为325 °C，雾化气压力为30 psi，干燥气流速为12 mL/min，离子扫描范围为100~1000 m/z。葡萄果皮的黄酮醇根据槲皮素3-O-葡萄糖苷的标准曲线进行相对定量，其浓度分别以mg/kg 鲜果重。安捷伦1200 高效液相色谱（HPLC）配备Poroshell 120 EC-C18 色谱柱（150 ×2.1 mm，2.7 μm）和安捷伦6400 三重四极杆串联质谱（QqQ-MS/MS）（Agilent，Santa Clara，CA，USA）用于葡萄果皮和种子黄烷醇的检测分析，仪器条件参照Li等人的方法。流动相A为0.1%甲酸水溶液（v/v），流动相B为含0.1%甲酸（v/v）的乙腈/甲醇（1:1，v/v）溶液。梯度洗脱程序为：0~28 min，10%~46%B；28~29 min，46%~10% B；29~34 min，10% B。流动相流速为0.4 mL/min，进样量为1 μL，柱温为55 °C。质谱参数如下：电喷雾离子源（ESI）温度为150 °C，喷雾电压4 kV，负离子模式，雾化气为高纯氮气，雾化气温度为350 °C，雾化气压力为35 psi，干燥气流速为12 L/h。葡萄果皮的黄烷醇根据儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素和表儿茶素-3-O-没食子酸酯的标准曲线进行定量，其浓度分别以mg/kg鲜果重表示

  2.5 统计学分析

  用R 4.0.5进行方差分析，P < 0.05 （邓肯多重检验）。图形是用OriginPro 2021（OriginLab Corp, Northampton, America）绘制的。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）用SMICA14.1进行的。

  3 结果和讨论

  3.1 气象条件

  通过分析4年的气象数据，发现2017年日照时间最长，2018年有效积温最高，降雨最多；2019年降雨量最小，2020年日照时间最短，有效积温最低。对4年的气象数据，进行PCA分析。如图1B所示，第一个主成分将2017年和2019年归为一类，2018年和2020年归为另一类，第二个主成分归为2019年和2020年为一类，2018年和2020年为另一类。2017年的日热指数（HI）高于其他年份的指数年份，这表明2017年的光和热更多，2019年的凉夜指数（CI）更高与其他年份相比，这表明2019年收获季节的热量更大。

  3.2 砧木对接穗树势和果实基本理化指标的影响

  具有不同遗传背景的砧木会赋予接穗不同的生长特性(表1)。1103P倾向于增加接穗的修剪重量，显著高于CS/5A。一些研究表明，1103P提高了接穗的产量，而我们的结果表明，1103P在2019年有提高产量的趋势，并表现为2020年的显著差异。总的来说，先前的研究表明砧木的活力和产量正相关的。在本研究中，砧木5A倾向于削弱葡萄树的活力。尽管砧木对以下方面有显著影响对接穗的产量和修剪重量的影响不大，但对Ravaz指数的影响不明显，而Ravaz指数对接穗的影响不大。与以前的一些研究结果一致。砧木对叶面积和穗重也没有显著影响。砧木对接穗的生长主要与不同砧木的遗传性状有关。1103P由V.berlandieri和V. rupestris杂交而来，而V. rupestris多生长于砾石和沙质土壤，根系深。而V. berlandieri原产于石灰质高pH值土壤。因此，我们推断，由V. rupestris和V. berlandieri杂交而来的1103P，可以吸收更多的水分和营养物质供应接穗营养生长，使得接穗的修剪重量增加。5A和SO4由V. berlandieri和V. riparia的杂交而来，具有浅根的生长习性和适应性。尽管5A和SO4有相同的亲本，但SO4赋予了更高的接穗的生物量，这表明即使是具有相同亲缘关系的砧木仍然有不同的影响在子代上。

  对于果实的基本理化指标，在连续4个年份中，如表2所示，砧木对浆果的百粒重并无显著影响，这与之前的一些结果一致。但CS/5A组合的可溶性固形物含量高于CS/1103P，与CS相比没有显著差异。1103P在两个年份（2019年、2020年）显著提高了果汁的可滴定酸度，但在2017年和2018年与其他组合没有表现出显著差异，与CS/SO4组合结果一致。对于果汁pH，三个砧穗组合和CS之间差异很小。双因素方差分析表明年份和砧木之间的综合影响，在光照多、雨水少的年份，如2019年，浆果的可溶性固形物含量高，可滴定酸度低。这可能是因为充足的光照和较少的降水促进了可溶性固形物的积累和可滴定酸的分解，从而加速了葡萄的成熟。

  3.3 砧木对接穗果实花色苷含量的影响

  砧木对浆果中花色苷浓度的影响与一些研究人员一致，不同的砧木对浆果中的花色苷浓度有显著影响。由图2可知，与自根苗相比，1103P在4个年份中降低了浆果中的总花色苷浓度。SO4有降低花色苷浓度的趋势。SO4在2017年和2020年的降低了浆果中的花色苷浓度，但其含量仍高于CS/1103P组合。与CS相比，CS/5A组合并没有显著性差异。在本实验中，果皮中共检测到16种花色苷，其中最主要的类型是二甲花翠素类花色苷。1103P嫁接的‘赤霞珠’的二甲花翠素浓度显著CS相比，而且这种差异在2020更为显著。这可能是因为在雨水少、光照多的年份会掩盖砧木带来的差异，而过多的降雨和光照不足会对树体的生长形成胁迫，这种胁迫更有利于砧木特性的发挥。此外，1103P修剪重量最大，并且有增加叶面积的趋势，这就会造成导致光线郁闭，从而影响花色苷的积累和合成。修剪重量的增加也意味着更多的光合作用产物在枝条上进行积累，改变了源-汇的关系，这可能也解释了CS/1103P组合果实中可溶性固形物较低的原因。有研究表明，编码花色苷生物合成途径中的关键酶受到糖类物质的调节。因此，花色苷浓度的降低可能是由于较低的糖含量造成的。此外，SO4降低了‘赤霞珠’中花色苷的浓度。Wang等人也有类似的发现。但CS/SO4组合与CS/1103P组合相比，具有更高的花色苷浓度浓度。Ozden等人在‘西拉’中也有类似的发现。相比之下，CS/5A组合的糖分和花色苷浓度更高。尽管它没有与CS相比，并没有显著差异。Wang等人也发现与CS/SO4相比，CS/5A组合的花色苷浓度更高。对于所有的嫁接组合，2019年浆果中花色苷的浓度都高于其他年份。从气象数据来看，我们发现该年份的雨水较少，光照充足。特别是在转色期，这对花色苷的合成是有利的。在这种年份，砧木对接穗中花色苷的浓度影响较小，而在一个在光照不足和降水较多的年份，砧木对总的影响更大。在2019年，CS/1103P组合与CS相比，花色苷的总浓度下降了8.04%，而在2020年，与CS相比，CS/1103P组合的花色苷浓度下降了24.93%。实验证明，光照少、雨量大的胁迫环境放大了砧木的影响。Oliveira等人发现砧木和年份具有协同效应，而年份具有对类黄酮化合物浓度的影响更大，西拉中也有类似的发现。在这些研究中，不同年份的同一砧穗组合的花色苷浓度差异要远大于同一年份的不同砧穗组合之间的差异，所以我们认为年份是浆果中花色苷浓度的决定因素。

  3.4 砧木对接穗果实黄酮醇浓度的影响

  在本研究中，发现CS/1103P组合果皮中的黄酮醇浓度较低（图3）。在所有年份中，这种下降主要是由低浓度的槲皮素和杨梅酮引起的。而CS/5A组合在大多数年份有更高的黄酮醇。此外，CS/SO4与CS相比，没有显示出显著的差异。有研究发现，5A、Harmony和Riparia Gloire增加了接穗果实中黄酮醇的浓度。很明显，年份是决定的关键黄酮醇的浓度。在2017年和2019年，黄酮醇显示出较高的水平。许多研究表明，由于包括黄酮醇合成酶在内的关键基因的表达增加，充足的光照会增加果实中黄酮醇的浓度。因此，在雨水少、光照充足的年份，如2019年，浆果中的黄酮醇含量较高。在四个年份中，CS/5A组合的黄酮醇浓度比CS/1103P组合高。这种差异是主要由槲皮素引起，这表明砧木5A可能有利于合成槲皮素合成，而1103P则不利于槲皮素的合成，这也有可能是因为1103P有较高的修剪重量，造成枝条郁闭，导致光照不足，进而影响黄酮醇的积累，而5A的修剪重量相对较低，这使得浆果接受更多的光照，更有利于黄酮醇的合成。槲皮素主要是由F3′H途径产生，而杨梅酮则主要由F3′5H′途径产生。这表明光对由F3′H途径合成的黄酮醇的影响可能大于由F3′5H′合成的黄酮醇路径。

  3.5 砧木对接穗果实中黄烷醇浓度的影响

  黄烷醇大部分在葡萄浆果的种子中积累。砧木对黄烷醇的浓度没有显著的影响，这表明黄烷醇的浓度相对稳定，不容易受到栽培措施的影响。虽然砧木之间的黄烷醇浓度没有显著差异，但1103P仍然倾向于促进黄烷醇的积累，5A则有减少黄烷醇的积累的趋势。这可能是收获时的较低TSS（约21°Brix）。这可能导致更多的聚合单宁的积累。如果浆果达到较高的成熟度阶段，其结果可能会发生变化，因为单宁的含量会减少或与其他类黄酮化合物发生聚合反应。与花色苷不同，黄烷醇在在光照充足、雨水较少的年份，如2019年，含量相对较低，而在光照不足、雨水较多的年份（2020年）含量则相对更高。这种差异可能是由于黄烷醇的积累模式造成的。研究表明，在葡萄果实中黄烷醇的积累模式呈现出先上升后下降的趋势。一般来说，在转色期达到最高浓度，然后呈现下降趋势，但此时花色苷的合成呈现出快速积累。结合物候期，在光照不足年份，果实发育期往往有更多的降雨，而降雨会减缓花色苷和黄酮醇的积累，同时黄烷醇的分解速率也会下降。与大多数研究一致，年份是影响果实中黄烷醇差异的主要原因。但也有研究表明，1103P和SO4增加了‘美乐’葡萄果实中黄烷醇浓度，这可能是由于品种和立地条件的差异造成的。

  3.6 主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析分析

  为了进一步确定不同嫁接组合中黄酮类代谢物的特征，采用了PCA进行分析。遗憾的是，PCA没有将砧木组合分开，而是将它们从年份中分离出来，这表明年份在浆果中的黄酮类物质浓度中起到了关键作用（图4A）。第一主成分（PC1）解释了总方差的30.3%，将2017年和2019年分为一组，将2018年和2020年分为另一组。如图1B所示，2017年和2019年，以及2018年和2020年的气候条件相似。我们推测，气候相似的年份可以赋予浆果类似的类黄酮组分。第二主成分（PC2）解释了总方差的27.1%，将2017年和2020年分为一组，将2018年和2019年分为另一组。为了减少年份之间的干扰，运用OPLS-DA进行分析不同砧穗组合之间的类黄酮物质组成。然而，当我们试图用所有的年份来训练模型，发现其模型是不可靠的，尽管我们可以很好地分辨出嫁接组合和自根苗。我们通过当我们去掉2017年的黄酮类化合物并与其他年份的黄酮类化合物进行拟合时，能够构建一个更可靠的OPLS-DA模型。如图4B所示，第一个主成分区分了CS/1103P组合和CS，第二个主成分区分了各年份。通过筛选VIP>1的化合物，我们可以看到T-An、F3′5′H-An、F3′H-An、Mv-glu、Mv-acglu、C-seed、skin-F3′H、Seed-F3′H和C-P-seed是区分CS/1103P组合与CS的关键化合物。同样，我们为CS和SO4/CS组合建立了OPLS-DA模型（图4D），Mv-acglu、Mv-coglu-trans、Mv-glu、T-An和F3'H-An可被视为区分它们的差异性化合物。对于CS和CS/5A组合（图4C），Mv-coglu-trans、Dp-acglu、Pn-coglu-trans、Dp-glu、F3′H-An、Qu-glu、EGC-seed、C-seed和F3′5′H-seed可以作为区别它们的差异化合物。总的来说，花色苷是受砧木影响的主要代谢物，特别是以二甲花翠素类花色苷。此外，利用维恩图进一步寻找三组中共同的差异性化合物（图4E）。我们发现T-An和F3′H-An是三组中共同的差异化合物，这进一步说明砧木确实会在一定程度上影响浆果中的花青素浓度。

  4 总结

  中国东部的葡萄栽培区气候具有多雨和多云的特点，与地中海气候区相比，葡萄生长面临的胁迫更大。本研究有助于回答砧木在面对气候胁迫时是否表现出独特的特性。该实验表明，1103P倾向于推迟‘赤霞珠’葡萄的成熟，其接穗果实中花色苷和黄酮醇的浓度较低，而5A促进了‘赤霞珠’浆果的成熟，降低了葡萄树的活力，促进了浆果中花色苷的积累。此外，年份和砧木之间存在交互影响，砧木在雨天和阴天较多的年份对类黄酮的积累起到了关键作用。光照充足的年份在一定程度上会掩盖了由砧木引起的差异。考虑到砧木对葡萄中类黄酮积累的影响，在光照不足和多雨的地区，推荐嫁接‘赤霞珠’的5A而不是1103P。在本研究中，使用了三种砧木来嫁接‘赤霞珠’，未来将研究更多的嫁接组合，为砧木的使用提供多种选择。