苗木生产岗位

史宁 卢浩成 王军

 

  0 引言

 

  葡萄酒中的风味物质主要包括酚类物质和香气物质。酚类物质（Phenolic Compounds），是葡萄酒中非常重要的次级代谢产物。根据葡萄果实中酚类物质的存在位置可以为两类：主要在外果皮、种子中积累的类黄酮类化合物和主要在果肉中积累的非类黄酮类化合物，类黄酮类化合物是自然界中分布较广的酚类物质，主要包括花色苷类、黄酮醇类和黄烷醇类。酚类物质对红葡萄酒的颜色和收敛性也非常重要，能够赋予葡萄果实和葡萄酒以稳定优质的色泽和饱满丰富的口感。同时酚类物质也被认为是葡萄酒保健功能的来源，作为一种天然生物活性物质，利用其抗氧化、抑菌消炎、防治心血管疾病和防治糖尿病慢性并发症等生物活性，被广泛应用在功能性食品、保健食品、日用产品及药品等领域。香气物质对葡萄酒的风格和典型性起到了至关重要的作用，在很大程度上决定着葡萄酒产品的市场接受度。目前在葡萄酒已鉴定出数百种挥发性香气物质，包括高级醇类、酯类、脂肪酸类、吡嗪类、萜烯类、降异戊二烯类、挥发性酚类、内酯类和硫化物等这些化合物之间通过相互作用影响葡萄酒的风味和香气。酿酒葡萄原料的品质很大程度上决定了其所酿葡萄酒的风味和品质。通常将这种由酿酒葡萄果实原料带来的香气称为“品种香”。发酵类香气物质来源于酒精发酵和苹果酸乳酸发酵阶段，主要包括高级醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯和脂肪酸类等。通过栽培措施影响葡萄果实的代谢进而影响所酿葡萄酒的感官是目前研究的焦点。

 

  酵母提取物作为一种新型的生物型诱导子已经被国外广泛使用，例如LalVigneTM Mature（拉曼公司，法国），成分为100%的酿酒酵母提取物，用于喷施在葡萄叶面上来提高葡萄果实及葡萄酒中的酚类物质。酵母提取物中含有几种可作为诱导子的化合物，主要有酵母细胞壁中的甘露蛋白、葡聚糖和几丁质，以及酵母质膜中的脂类、固醇和蛋白质。这些化合物能够触发各种植物防御模式。植物在酵母提取物的刺激下，可以增强自身碳水化合物的积累，从而使得叶、茎和根的数量和重量增加。目前关于酵母提取物在葡萄中的应用很多，但是相关报道却比较少，Portu等人在‘丹魄’（Vitis vinifera L. cv. ‘Tempranillo’）葡萄叶面喷施酵母提取物，结果表明酵母提取物可以诱导葡萄酚类物质的生物合成，相比于喷施茉莉酸甲酯和壳聚糖，更加能够提高葡萄和葡萄酒中花色苷的含量。Villangó等人在西拉葡萄叶片上喷施酵母提取物，结果显示葡萄果实的果皮变厚，果实中可溶性固形物的含量升高，可滴定酸的含量降低，酒中花色苷的含量也明显升高。国内的相关研究则显示喷施处理能够提高美乐葡萄果实中类黄酮类物质和还原谷光甘肽的含量。

 

  本研究通过对‘赤霞珠’葡萄树叶面进行酵母提取物的喷施，测定果实采收后所酿葡萄酒中的酚类物质和香气物质，拟为此栽培措施的进一步应用提供理论依据。

 

  1 材料与方法

 

  1.1 材料

 

  实验材料为2013年定植的‘赤霞珠’葡萄。实验地位于新疆中信国安葡萄酒业有限公司自建基地（44°14′N，86°15′E），植株株行距为1 × 3 m。采用改良VSP（“厂”字形）叶幕整形，主干高度约65 cm，自根苗。

 

  2020年选取试验田中40行长势良好，且较为一致的葡萄植株作为试验对象。每20行为一个实验小区，每个小区包含两种实验处理：对照组和喷施组。实验组喷施酵母提取物，用量为厂家推荐用量（1 kg/ha），使用0.1% v/v吐温80水溶液作为叶片表面活性剂，对照组只喷施0.1% v/v 吐温80水溶液。分别于果实转色5%、转色完成进行喷施。喷施部位为叶面背面，喷施均匀直至有液滴自然滴落为止。

 

  1.2 方法

 

  1.2.1 葡萄果实基本理化指标的测定

 

  在果实发育期定时进行采样，每次采样采集100粒浆果，重量用分析天平称量，计算浆果百粒重和平均单粒质量。随机选取100粒浆果挤出果汁，用手持糖度计（PAL-1, Atago, Japan）测定果汁可溶性固形物含量，用pH计测定果汁pH值；可滴定酸使用NaOH滴定，以酒石酸计（g/L）。

 

  1.2.2 大生产发酵

 

  商业采收期对葡萄果穗进行手工采收并运送至酒厂。除梗破碎机进行除梗后加入60 mg/L SO2，原料入罐后加入20 g/hL的商业酵母以启动酒精发酵，发酵温度24~26℃。酒精发酵结束后，人工接种乳酸菌LALVIN31（Lallemand，法国）启动苹果酸乳酸发酵，发酵温度18~20℃。

 

  1.2.3 葡萄酒酚类物质检测

 

  葡萄酒酚类物质检测采用美国Agilent 1200系列高效液相色谱仪，配备6410三重串联四级杆质谱仪（QqQ）。所用色谱柱为Poroshell 120 EC-C18色谱柱。样品测定前经0.22 μm水系滤膜过滤，进样量5 μL。洗脱采用的流动相为：0.1%的甲酸水溶液为A相，含0.1%甲酸的50/50的甲醇乙腈溶液为B相。流动相流速为0.4 mL/min。柱温箱温度控制在55°C。质谱采用AJESI离子源，喷雾电压为4 kV，离子源温度为150°C，干燥气温度为350°C，流量为12 L/h，雾化器压力为35 psi。检测器为多反应监测模式（MRM）。

 

  花色苷的检测采取正离子模式，洗脱程序为10%~100%的B相持续15 min，后运行程序5 min。非花色苷酚采取负离子模式，梯度洗脱程序为0~28 min，10%~46% B；28~29 min，46%~10% B，后运行程序5 min。

 

  花色苷及非花色苷酚的定性依据为农业农村部葡萄酒加工重点实验室所建立的葡萄与葡萄酒酚类物质（高效液相色谱-质谱联用）指纹谱库。定量采用外标法定量，花色苷定量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为外标物，黄酮醇以槲皮素为外标物，黄烷醇以儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素和表儿茶素没食子酸酯为外标物，单位表示为mg/kg FW（果实鲜重）。

 

  1.2.4 葡萄酒香气物质检测

 

  利用农业农村部葡萄酒加工重点实验室已优化的顶空固相微萃取方法对葡萄汁和葡萄酒香气物质进行萃取，并利用气质联用的方法分析样品中的香气物质。SPME萃取头采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS（Supelco, Bellefonte, PA., USA），采用CTC CombiPAL autosampler多功能自动进样器（CTC Analytics, Zwingen, Switzerland）实现自动化的顶空固相微萃取。20 mL玻璃样品瓶中加入5 mL 葡萄酒样品、1 g NaCl 和10 μL 内标（4-甲基2-戊醇，1.0086 g/L），然后迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子拧紧。样品瓶首先在40°C加热槽中振荡30 min，振荡速度为500 rpm，然后将已活化的 SPME萃取头插入样品瓶的顶空部分，在40°C下继续振荡30 min后，取出SPME萃取头，立即插入气相色谱进样口，进样口温度为250°C，热解析8 min。每个样品重复萃取三次。GC-MS分析采用7890-5975气相色谱-质谱联用仪（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA），色谱柱为HP-INNOWAX（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm, J&W Scientific, Folsom, CA, USA）。载气为高纯氦气（＞99.999%），流速为1.0 mL/min；采用5：1分流进样，进样口温度为250°C。柱温箱的升温程序如下：起始温度为50°C，保持1 min，然后以3°C/min 的速率升温至220°C，保持5 min。质谱采用电子轰击离子源（EI），电离能量为70 eV，离子源温度为230°C，四级杆温度为150°C，辅助加热器温度为250°C，质量扫描范围为30-350 u。

 

  1.2.5 数据处理

 

  采用SPSS 22.0进行统计分析。

 

  2 结果与分析

 

  2.1 喷施酵母提取物对葡萄浆果基本理化指标的影响

 

  喷施酵母提取物对葡萄浆果基本理化指标的影响如表1所示，共选择了两个采样点进行了基本理化指标的检测：转色后和采收期。结果表明，喷施酵母提取物后，葡萄浆果的可溶性固形物含量并未受到显著影响。可滴定酸方面，在转色后期，喷施组显著提高了果实中的可滴定酸浓度，但此差异在采收期消失。浆果pH呈现出相似的规律：转色后期喷施组的浆果pH显著低于对照组，采收期差异消失。喷施组对浆果百粒重无显著影响。

 

 

  2.2 喷施酵母提取物对葡萄酒单体花色苷的影响

 

  喷施酵母提取物对葡萄酒中单体花色苷类物质的浓度如表2所示。共检测到十五种单体花色苷类物质，包括未经修饰的葡萄糖苷花色苷以及乙酰化和香豆酰化的花色苷。喷施组的总单体花色苷浓度虽然高于对照组，但并不显著。对具体的单体花色苷物质而言，只有花青素-3-葡萄糖苷物质的浓度在喷施组中显著提高了。这表明喷施酵母提取物对葡萄酒中的单体花色苷的影响是有限的。

 

 

  2.3 喷施酵母提取物对葡萄酒聚合花色苷的影响

 

  喷施酵母提取物对葡萄酒中聚合花色苷类物质的浓度如表3所示。共计四类聚合花色苷类物质，包括乙醛桥连聚合花色苷，乙烯基黄烷醇吡喃花色苷，乙醛复合型吡喃花色苷和酚基吡喃花色苷。聚合花色苷类物质作为葡萄酒维持其颜色稳定性的重要物质，其含量高低影响着葡萄酒感官的好坏。从结果上看，喷施组和对照的总聚合花色苷浓度并没有显著差异。但是酚基吡喃花色苷在喷施组中的浓度显著高于对照组，这表明喷施组对酚基吡喃花色苷有显著的提升作用。

 

 

  2.4 喷施酵母提取物对葡萄酒非花色苷酚的影响

 

  喷施酵母提取物对葡萄酒中非花色苷酚类物质的浓度如表4所示。共检测到17中非花色苷酚物质，包括7种黄烷醇类物质和10种黄酮醇类物质。从总量上看，喷施组的黄烷醇类物质浓度要高于对照组，但未达到显著水平。但对具体的黄烷醇物质而言，喷施组显著提高了葡萄酒中的表儿茶素，表棓儿茶素和杨梅酮物质的浓度。非花色苷酚类物质不仅可以为葡萄酒提供口感，同时还能够作为辅色素与单体花色苷类物质进行聚合反应，有利于葡萄酒的稳定性。以上的结果表明，喷施酵母提取物对葡萄酒中的酚类物质有提升作用。

 

 

  2.5 喷施酵母提取物对葡萄酒香气物质的影响

 

  本研究中通过气相色谱质谱联用技术共检测到63种香气物质，包括3种C6醇类物质，9种芳香族类物质，17种高级醇类物质，2种降异戊二烯类物质，3种萜烯类物质，2种醛/酮类物质，6种脂肪酸类物质和20种酯类物质。

 

  与对照相比，叶面喷施处理显著提高了葡萄酒中的1-己醇和(E)-3-己烯-1-醇两种C6醇类物质的浓度。一般来说，植物中来自于脂氧合途径的挥发性化合物主要有C6和C9的醛、醇和酯。他们来自于亚油酸和亚麻酸的降解，由于六碳直链脂肪族类化合物具有典型的绿叶香气而被统称为“绿叶气味化合物”。对于红葡萄酒来说，C6醇类物质会给葡萄酒带来生青味，从而给人以不成熟的感官印象。在本研究中，叶面喷施组对于C6醇类物质的提升会加重葡萄酒的生青味，在此方面对葡萄酒有不利的影响。

 

  苯类物质作为芳香族类物质，对葡萄酒的香气也具有一定影响。本研究中检测到的9种苯类物质中，对照组和喷施组没有显著差异。

 

  高级醇（又称杂醇）一般指具有两个以上的碳原子的一元醇，是酵母代谢中的重要副产物[13]。葡萄酒中低浓度的高级醇，会增加葡萄酒的香气复杂性；但高浓度杂醇给葡萄酒带来异味，容易引起饮酒后“上头”，甚至给身体健康造成伤害。在检测到的17中高级醇类物质中，仅有2-甲基-1-丁醇受到喷施处理的显著影响且在喷施处理葡萄酒中具有较低的浓度。

 

 

  来源于葡萄果实中的香气物质主要有萜烯和降异戊二烯等。二者在酿酒葡萄中的含量相对较低，均来源于异戊二烯代谢，阈值较低，主要呈现“花”、“果”香气，且多以糖苷结合态的形式存在，其糖苷结合态可经过酶解或酸解，形成游离态香气，对葡萄果实及葡萄酒的香气有着极其重要的潜在作用。在麝香型的葡萄品种中，萜烯类化合物是品种香的主要贡献者，而在非芳香型的葡萄果实中，萜烯类化合物的含量通常较低，而降异戊二烯的含量总是远高于阈值，主要为β-大马士酮，为‘赤霞珠’等非芳香型葡萄品种的葡萄酒提供了怡人的“玫瑰花”香。在本研究中，喷施组处理显著提高了葡萄酒中的香叶基丙酮和香茅醇两种物质的浓度，其中香叶基丙酮的含量提升了41%，香茅醇的含量提升了30%。这表明喷施组对葡萄酒中的花香和果香具有促进作用。

 

  对葡萄来说，脂肪酸作为一类重要的植物主代谢产物，对植物的生长发育具有重要的生理功能，其合成是植物品种适应外界环境条件的结果。来源于葡萄果实本省的香气中，一些直链脂肪族饱和或不饱和的脂肪醇、脂肪酮、脂肪酸酯类物质均来自果实中脂肪酸的降解，这类香气物质通过影响葡萄果实香气对葡萄酒的香气产生影响。发酵香气主要来源于糖代谢和氨基酸代谢途径，属于酵母等微生物代谢组用产生的副产物，包括乙醇、高级醇、脂肪酸等，这类香气成分在总香味物质中一般占有最大的比例。在测定的6种脂肪酸物质中，喷施组显著提高了葡萄酒中辛酸和癸酸的浓度。

 

  除以上的香气物质，酯类物质中受喷施组处理的影响最大。测定出的20种酯类物质中，8种物质均受到喷施组的显著影响。其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、己酸异戊酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯和9-癸烯酸乙酯均在喷施组中的浓度显著提升了。这些酯类物质作为贡献葡萄酒中果香的主要来源，表明叶面喷施酵母提取物处理提升了葡萄酒中的果香，这与之前分析的萜烯和降异戊二烯两类物质的结果一致。

 

  3 结论

 

  本研究主要探究了喷施酵母提取物对‘赤霞珠’葡萄酒中酚类物质和香气物质的影响。从结果来看，在酚类物质上，叶面喷施酵母提取物提高了转色后果实中的可滴定算含量，但采收时差异消失。喷施酵母提取物对葡萄酒中单体花色苷含量影响不大，但显著提高了酚基吡喃花色苷类聚合花色苷类物质的浓度，同时也提高了葡萄酒中非花色苷酚类物质的浓度。在香气物质上，本研究在‘赤霞珠’葡萄酒中共检测出63种香气物质，叶面喷施酵母提取物提高了葡萄酒中的萜烯、降异戊二烯和酯类物质的浓度，对葡萄酒中的花香和果香有显著的提升作用。但喷施酵母提取物提高了葡萄酒中的C6醇类物质的浓度，增加了葡萄酒的生青味，也有一定的负面影响。总体来看，喷施酵母提取物对葡萄酒品质的提升有促进作用。