酿酒葡萄栽培岗位
光对葡萄果实的生长发育起着重要的作用，花色苷的合成与积累更是受到多种光环境的影响。一方面，随着高海拔优质酿酒葡萄栽培产区的出现，葡萄园接收到的紫外和红外辐射增多，加之全球气候变化臭氧层稀薄，紫外和红外效应加强；另一方面，叶幕对红光和蓝光的选择性吸收和对红外光、紫外光的选择性透过使得葡萄果实处于一个紫外和红外光富集的光环境中。
自然环境中红外光谱组分占比为53%，远高于可见光谱和紫外光谱组分比例。红外辐射对植物的作用主要表现在热效应上，一般不能或很少被植物吸收。但有研究表明，红外辐射可以促进酚类物质的释放，提高葡萄果实的抗氧化活性，并通过提高相关代谢酶的活性，从而促进非类黄酮多酚物质的生物合成。红外辐射对酚类物质的合成影响显著，但对葡萄果实花色苷的研究还未见报道，相关调控机制仍不清楚。尽管紫外辐射在太阳辐射中仅占3%左右，但UV-A、UV-B和UV-C仍对葡萄果实的生长发育和酚类物质的积累有显著影响。UV-A影响葡萄果实成熟期花色苷积累的研究已有相关报道，但对葡萄果实转色期UV-A响应及调控机制仍不清楚。因此，探究紫外和红外辐射影响葡萄果实品质的关键组分，并结合转录组和代谢组联合分析，筛选差异基因和差异代谢物，探索紫外辐射与红外辐射调控葡萄果实关键组分合成机制。充分理解葡萄对非可见光的响应将有助于促使关键发育过程的正常进行，从而对保障产量、提高果实品质起到积极作用。
1 材料与方法
1.1 材料
供试品种为酿酒葡萄品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon），位于陕西省杨凌区曹新庄葡萄种植示范园。2018年定植、南北行向、株行距1.0 m×3.0 m、单干单臂整形、短梢修剪、常规管理。
1.2 试验设计
1.2.1 紫外和红外阻隔
以曹辛庄葡萄种植示范园酿酒葡萄赤霞珠为试验材料，花后30 d进行套袋处理，设置紫外阻隔套袋和无功能透明套袋2个处理，共处理40果穗。分别于套袋处理40、54、68、82、96和103 d（days after treatment, DAT）后采集样品，每次采样6穗。采后样品分别保存在-40℃和-80℃冰箱中。
1.2.2 外源紫外和红外辐射
以绿果期酿酒葡萄赤霞珠为试验材料，采集36穗葡萄，在恒温培养箱中离体培养，设置紫外辐射与黑暗条件对照、红外辐射与黑暗条件对照4个处理，每个处理9穗，分别于3、6和9 d后采样，每次采样各3穗。采后样品立即保存在-80℃冰箱中。处理后3 d果穗用于转录组和非靶代谢组分析。
1.3 测定方法
1.3.1 常规理化指标的测定
随机挑选100粒葡萄果实，用数显游标卡尺分别测量果粒横纵径，并测定果粒单粒重；将100粒葡萄果实去籽后打成匀浆，7756 g离心5 min，取上清，滤膜过滤后上机检测。FTIR葡萄酒分析仪测定果糖、葡萄糖、可溶性固形物、可滴定酸度、苹果酸和酒石酸含量，每个样品重复测定3次，取平均值。
1.3.2 花色苷及非花色苷组分测定
花色苷和非花色苷酚类物质含量通过高效液相色谱（LC-20A，岛津，日本）测定。花色苷组分测定：准确称取1.0 g葡萄果皮粉末于离心管中，加入5 mL甲醇溶液，避光超声10 min后摇床30 min，取出后8000 r/min 离心5 min，取上清后重复提取2次，合并上清液，采用岛津LC-20A 超高效液相色谱进行测定。色谱柱采用Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm粒度色谱柱）；流动相A为水：乙腈：甲酸=32:4:1；流动相B：水：乙腈：甲酸=16:20:1（体积比）。洗脱程序为：0~15 min，0~10% B；15~30 min，10~20% B；30~45 min，20~35% B；45~46 min，35~100% B；50~51 min，100~0% B；流速：1 mL/min；柱温35℃；检测波长520 nm；进样量20 μL。
非花色苷组分测定：准确称取2.0 g葡萄果皮粉末于离心管中，加入2 mL乙酸乙酯，25℃避光摇床30 min，取出后8000 r/min 离心5 min，收集上清，重复提取3次。将上清液合并后转入快速溶剂蒸发仪，待有机相吹干后色谱甲醇定容至2 mL。色谱柱采用Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm粒度色谱柱）；流动相A为水：乙腈：冰乙酸=800:100:1；流动相B：水：乙腈：冰乙酸=400:500:1（体积比）。
1.3.3 香气物质分析
葡萄果实香气成分采用顶空SPME结合气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）联用法进行分析。
香气物质提取：从-80℃冰箱中取出100粒葡萄果实，去籽，打成匀浆，然后于4℃下8000 r/min离心5 min，得到澄清葡萄汁。
香气物质测定：取8 mL葡萄汁和20 μL内标溶液（40 ug/L 2-辛醇）置于20 mL装有磁力搅拌子的顶空瓶中，加入2.0 g氯化钠，启动搅拌子，在40℃水浴中平衡15 min，然后插入萃取纤维，在40℃吸附30 min后立即将萃取头在GC进样口热解吸（230℃）5 min。采用标准品保留时间对比、保留指数对比和NIST 2017质谱谱库查询进行香气化合物定性。采用内标-标准曲线法定量。通过香气标准品和2-辛醇的相对峰面积建立标准曲线，R2在0.99以上。将准确定性物质代入标准曲线计算获得定量结果。
1.3.4 基因的表达水平检测
基因表达分析使用通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）（百泰克，北京，中国）提取赤霞珠葡萄果皮RNA，随后使用EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (AE311, TransGen Biotech, 北京, 中国)反转录合成cDNA。采用ChamQTMSYBR® qPCR Master Mix（Q311-02/03, Vazyme）试剂盒检测果皮中与花色苷合成直接相关的3个转录因子和7个结构基因的表达水平，以及BBX基因家族8个基因的表达特性，采用实时荧光定量PCR系统进行实时定量（QuantStudioTM6, ABI, 美国）。采用2-∆∆Ct，∆Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参几何平均值）。每个发育期样品的基因表达量为3个生物学重复的平均值。
引物设计
根据GeneBank中相关基因的保守序列，利用Primer5.0软件设计PCR扩增引物序列。
1.4 数据分析
试验数据采用Graphpad Prism 9.0进行作图及差异显著性分析。
2 初步结果
2.1 UV-A阻隔对葡萄果实横、纵径和单粒重的影响
如图1所示，UV-A阻隔下葡萄果实横纵径和单粒重略高于对照。总体来说，UV-A阻隔后对葡萄果实体积和重量影响均较小。
2.2 UV-A阻隔对葡萄果实糖酸含量的影响
UV-A阻隔显著降低了葡萄果实可溶性固形物、葡萄糖和果糖含量，提高了可滴定酸和苹果酸含量。
1.3 UV-A阻隔对葡萄果实颜色特性和花色苷含量的影响
由表1可知，UV-A阻隔后，葡萄果实单体花色苷含量均显著低于对照，UV-A阻隔后对酰化花色苷的前期积累影响较大，因此40和54两个时期并未检测到酰化花色苷含量。
1.4 UV-A阻隔对花色苷合成相关基因表达量的影响
由图3可知，与对照相比，紫外阻隔下54、68和82三个时期3个转录因子VvHY5, VvHYH和VvMYBA1基因表达均下调，7个VvBBX家族基因（除VvBBX23、VvBBX3外）表达均下调，9个花色苷合成途径结构基因包括VvF3’5’H、VvF3’H、VvANR、VvCHI、VvUFGT等均表达下调；花色苷合成途径结构基因与VvBBX家族基因以及3个转录因子VvHY5, VvHYH和VvMYBA1之间以正相关关系为主。其中，VvHY5与VvBBX6、VvBBX9、VvBBX18、VvBBX22、VvF3’5’H基因表达量均呈显著正相关关系。
3.5 UV-A辐射对葡萄果皮颜色及花色苷含量的影响
由表2可知，UV-A照射可以促进葡萄果皮着色，总花色苷含量得到显著提高，其中二甲花翠素3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷提高幅度最大。且结合UV-A阻隔结果来看，UV-A照射能够促进酰化花色苷的积累。
3 结论
（1）UV-A阻隔降低了葡萄果实果糖、葡萄糖含量，提高了可滴定酸含量，葡萄果实着色较慢，颜色相对偏绿和黄，单体花色苷含量均显著低于对照，但对果实生长影响较小。花色苷合成途径上相关基因表达均受到抑制，其中处理后82 d抑制作用最显著。
（2）外源UV-A照射能够促进葡萄果皮着色，颜色相对偏红和蓝，显著促进酰化花色苷的合成，尤其是二甲花翠素3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷提高幅度最大。
（3）综合来看，UV-A能够促进葡萄果实着色，提高花色苷含量，且HY5可能在UV-A调控花色苷合成途径中起着关键作用。
4 尚需进行的工作
尚需要对红外光条件下相关试验数据进行整理分析，并对UV-A不同光照强度以及与温度互作等方面做进一步的研究。
