酿酒微生物岗
刘延琳
1.氨基甲酸乙酯的危害
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）又称尿烷、乌来糖、乌来坦、乌拉坦，分子式为C3H7NO2，是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品（如面包、乳酪、酸奶等）和酒精饮料（如葡萄酒、日本清酒和中国黄酒等）在发酵或贮存过程中天然的伴随产物。
EC具有口服毒性，同时具有多位点致癌性，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。人体摄入EC绝大部分是通过饮用酒精饮料，其中，葡萄酒是重要来源之一。2002年联合国粮食及农业组织确定EC为重点监控物质，并制定了国际标准，规定葡萄酒中其质量浓度不得超过20 μg/L，加拿大和美国佐餐葡萄酒中EC 的限量不得超过 30 μg/L 和 15 μg/L。中国目前尚未制订EC限量标准。2007年，世界卫生组织国际癌症机构将EC由2B类致癌物（或可能令人患癌的物质）正式归为2A类致癌物（可能令人患癌的物质），并限制了其使用范围。
2.氨基甲酸乙酯的产生机制和分子标志物
葡萄酒酿造过程中，EC的形成有5 条途径，即尿素、瓜氨酸、氨基甲酰磷酸、氰化物、3a,6a-二甲基甘脲（3a,6a-dimethylglycoluril，DMGU）与乙醇反应形成EC （Zimmerli等，1991；Wang等，2014）。尿素和瓜氨酸（主要来自于精氨酸的酵母和乳酸菌的新陈代谢）与乙醇的反应是EC的主要形成途径（Arena等，1999；Cerreti等，2016；）。在这两条主要的形成途径中，因为尿素浓度常高于瓜氨酸浓度，且瓜氨酸的醇解反应速率较低，所以EC主要来源于尿素形成途径（Moreno-Arribas等，2016）。
在葡萄酒中，EC前体物质的来源有多种途径。葡萄生长过程中，施用氮肥使果实中尿素含量增加；发酵过程中，酵母菌通过尿素循环途径，代谢底物中过量的精氨酸产生尿素（Bells等，2005），并释放到发酵液中，使酒中尿素含量升高（Mira等，2000）。瓜氨酸主要来自酿酒酵母细胞内的尿素循环途径和乳酸菌中的精氨酸脱亚氨基酶代谢途径（Vrancken等，2009；Azevedo等，2002）。酿造过程中，酵母降解精氨酸生成尿素和鸟氨酸，鸟氨酸在鸟氨酸氨甲酰转移酶的作用下，生成瓜氨酸；苹果酸乳酸发酵过程中，乳酸菌代谢精氨酸也会分泌瓜氨酸（Mira等，2000）。酵母和乳酸菌代谢精氨酸代谢产生的瓜氨酸部分与乙醇直接反应生成EC，部分在鸟氨酸氨基甲酰转移酶的作用下生成氨甲酰磷酸和鸟氨酸，氨甲酰磷酸与乙醇进一步生成EC。葡萄酒中EC前体物质氰化物有两种来源，一是葡萄籽中的氰苷水解形成氰化物，由铜离子催化，氧化形成氰酸盐，氰酸盐与乙醇反应生成EC （Zimmerli等，1991；Zhao等，2013）；二是在白兰地的蒸馏过程中，高温使部分尿素分解成氰酸，氰酸与乙醇反应生成EC。双乙酰和尿素反应生成DMGU，DMGU与乙醇反应生成EC。
3.影响氨基甲酸乙酯含量的因素
影响葡萄酒中EC含量的因素是原料状况和工艺，原料状况的影响包括：生态条件（温度、降水、极端气候）（Moreno-Arribas等，2016）、葡萄品种（Arena等，2013）、葡萄成熟度（Lago等，2017）及产区（Moreno-Arribas等，2016）；工艺的影响包括发酵条件和陈酿条件，其中发酵条件包括：酒种（Fu等，2016；Canas等，2008）、pH值（Jiao等，2014；Araque等，2013）、EC前体物质浓度（Bell等，2005；Zhao等，2013）和乙醇体积分数（Araque等，2013）等。
3.1.原料成熟度
实验表明，采用技术成熟前（19 °Brix）、理想成熟度（21 °Brix）及过熟（23 °Brix）的葡萄分别浸渍10 d，葡萄酒中EC质量浓度分别为23.6、66、96 μg/L （Lago等，2017），由此可见，葡萄成熟度与葡萄酒中EC质量浓度呈正相关。
3.2.发酵条件
发酵过程中，发酵温度、浸渍时间、葡萄汁营养剂添加、酵母种类、乳酸菌种类及EC前体物质浓度是影响葡萄酒中EC含量的重要因素。发酵温度可以影响EC的形成速度，发酵后期升温会加快EC的形成（Wang等，2014）。实验表明，浸渍时间通过影响EC前体物质的浓度影响EC含量，使用理想成熟度（21 °Brix）的葡萄浸渍10 d，EC质量浓度为66 μg/L，继续浸渍至20 d以上时EC质量浓度为76.3 μg/L，浸渍30 d，EC质量浓度可达89 μg/L （Lago等，2017）。尿素、瓜氨酸、精氨酸作为EC重要的前体物质，在葡萄汁中的含量影响着发酵结束后葡萄酒中EC的含量（Stevens等，1993）。研究表明，葡萄汁中尿素、瓜氨酸、精氨酸含量与EC生成量均呈线性关系（Hasnip等，2004）。在葡萄汁发酵前分别添加尿素、瓜氨酸，二者含量在发酵过程中均呈下降趋势，但EC含量不断增加，尿素的减少主要发生在酒精发酵过程中，且尿素代谢调控方式与参与的调节剂有关（Zhao等，2013），而瓜氨酸的减少主要发生在苹果酸—乳酸发酵过程中。葡萄酒生产过程中，精氨酸含量先上升后下降，EC含量呈明显上升趋势。精氨酸含量上升可能是由于酵母自溶，含量下降可能是由于乳酸菌代谢精氨酸产生瓜氨酸，使EC含量上升。因酵母生长繁殖的需要，发酵时加入氮源（如磷酸氢二铵）能明显加快发酵速率，防止发酵“阻滞”（Hasnip等，2004；Marks等，2003）。但添加过量的磷酸氢二铵会导致尿素的形成，尿素是EC重要的前体物质，并且部分酵母菌株对磷酸氢二铵的加入时间敏感，这也会影响EC的生成量（Lago等，2017）。酿酒酵母代谢精氨酸以及分泌尿素具有菌株特异性，car1基因通过编码精氨酸酶影响发酵液中精氨酸的含量（Moreno-Arribas等，2016；Guo等，2016），调控精氨酸脱亚胺途径arc基因的表达量也可以影响精氨酸的代谢率（Araque等，2009；Araque等，2012）。葡萄汁中的精氨酸可在酵母菌内代谢产生过量的尿素，从而导致葡萄酒中尿素含量升高（Mira等，2000）。苹果酸—乳酸发酵阶段，乳酸菌通过精氨酸脱亚氨途径代谢产生瓜氨酸，瓜氨酸是EC另一重要前体物质，不同种类的乳酸菌代谢精氨酸能力不同，生成EC前体物质的浓度不同，导致EC的产量有较明显差异，实验表明短乳杆菌较戊糖片球菌能够积累更多氨基酸，产生更多EC（Araque等，2013；Lasik等，2013）。
3.3.陈酿条件
研究发现，刚酿造的新酒中，仅仅满足高尿素含量时，EC并不能大量产生。贮存条件会影响葡萄酒中EC的最终浓度，如贮藏温度、通氧量及是否带酒脚陈酿（Larcher等，2013）。贮存期间，葡萄酒中EC含量随着储存温度和时间的增加而增加（Weber等，2009），贮存30 d后，30 ℃下的葡萄酒样品中EC含量约为15 ℃时的1.5～2.0 倍（Xue等，2015）。如果葡萄酒在陈酿期间处于通风状态，尿素则大部分被降解，积累减少，导致EC含量较少。带酒脚陈酿过程中，由于酵母自溶，EC的前体物质含氮化合物、氨基酸会逐渐释放到酒中，EC含量也因此有所增加（Moreno-Arribas等，2016；Terrade等，2006；Uthurry等，2006）。但有报道称，氨基酸含量低的葡萄所酿造葡萄酒即使延长与酒脚接触时间，也没有其他EC前体物释放（Hasnip等，2004）。
4.如何抑制氨基甲酸乙酯的产生
目前，EC的抑制途径大致分为4 类：选用代谢工程技术选育优良菌株、改良发酵原料、优化发酵和陈酿条件以及外源添加酸性脲酶。酸性脲酶可以催化尿素分解形成氨和二氧化碳，尿素是EC重要的前体物质，因此一定条件下，向发酵完全的酒中添加酸性脲酶，尿素的分解能降低葡萄酒中的总酚和EC其他前体物质的浓度，从而达到控制EC含量的目的（Cerreti等，2016）。该方法不改变酿酒的酵母菌株及工艺条件，能够在保证原酒风味特征的前提下，有效降低葡萄酒中的EC含量，同时操作简便有效，具有良好的应用前景。自1999年起，欧洲已获准从发酵乳酸菌中提取的酸性脲酶在葡萄酒中应用（Cerreti等，2016）。但目前，我国的脲酶生产尚未产业化，主要依靠进口，这增加了生产成本及工艺复杂性（Fidaleo等，2006）。而且由于脲酶是一类以镍作为辅基的金属酶，镍残留会严重影响葡萄酒安全性（Dixon等，1975）。除此之外，通过添加尿素吸附材料、EC降解酶、EC吸附剂等途径去除酒中EC的研究越来越多，但目前此类研究都集中在黄酒（Zhou等，2017；Fang等，2015）。
对发酵原料的优化主要体现在调整葡萄园管理措施上。葡萄的施肥、修剪、灌溉及地面覆盖等对葡萄汁中精氨酸浓度有很大影响（Soufleros等，2003）。因此，合理调整葡萄园管理措施，对葡萄原料进行优化，能够在一定程度上控制葡萄酒中EC的含量（Bell等，2005），目前鲜见具体改良方法的研究。
葡萄酒的发酵和陈酿条件在一定程度上影响了EC的形成。发酵及贮存的温度越高，EC的生成量就越多（Hasnip等，2004），当EC质量浓度不超过15 μg/L时，低温贮藏可限制EC质量浓度的增加。研究表明，当温度升高10℃时，尿素和瓜氨酸形成的EC分别增加了1.5~2倍和1.5~2.5倍（Xue等，2015）。
5.未来前景
消费者对于食品安全及健康越来越关注，EC作为一种在葡萄酒中广泛存在的有害物质，在我国目前还没有相关限量标准。在我国市场上仍有部分产品的EC含量超出联合国粮食及农业组织标准，这对消费者的健康造成了潜在威胁。葡萄酒中EC的主要形成途径是尿素及瓜氨酸与乙醇的反应；影响EC含量的因素有原料状况和工艺；控制消除手段主要包括选用优良菌株、改良发酵原料、优化发酵和陈酿条件，以及外源添加酸性脲酶，具体优化条件仍需要进一步研究。加强对葡萄酒中EC的研究，制定我国葡萄酒中EC的限量标准，通过技术手段控制EC含量，为消费者提供安全健康的葡萄酒产品，对规范葡萄酒行业生产秩序、保护我国葡萄酒消费者的健康及促进葡萄酒行业的持续发展意义重大。