鲜食葡萄品种改良岗位
挥发性酯类是美洲种葡萄及欧美杂交种葡萄中主要的香气组分，能够提供果实愉悦的果香味。目前，GC-MS在食品行业中常用于分析水果或酒类等食品香气成分。但仪器的系统误差会产生一个能可靠地检出的分析信号所需要的最小浓度或含量即检出限，检出限越低越有利于物质检测。一般来说GC-MS提供全扫描的实时数据采集功能，可根据全扫描结果获得定性、定量结果数据。但有些化合物在全扫描的数据采集过程中检出限较高，在较低浓度时不能被检测到，因此针对果香类化合物开发了一种全新的检测方法——Sim/Scan联用法。Sim法在质谱扫描过程中，仅扫描设定好的部分离子碎片，而Scan法则是扫描全部离子碎片。通过结合两种方法，明显扩大果香香气物质的线性范围，降低其检出限，为今后分析果香香气典型贡献物质提供理论基础。
1 材料
1.1 试验材料
葡萄果实采北京市农林科学院林业果树研究所。
1.2 试剂与标准品
香气标准品：乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、己酸异戊酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、丁二酸二乙酯、水杨酸乙酯、月桂酸乙酯、乳酸异戊酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、乙酸丁酯、呋喃酮、邻氨基苯乙酮、邻氨基苯甲酸甲酯、甲氧基呋喃酮、氧化玫瑰均采购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。
试剂：分析纯氯化钠、酒石酸、氢氧化钠、葡萄糖和蒸馏水均购自北京化学试剂公司；色谱纯乙醇购自Honeywell (Morris Township, NJ)；D-葡萄糖酸内酯（D-gluconic acid lactone）、聚
乙烯基吡咯烷酮（PVPP）和C6-C24正构烷烃均购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)
1.3 试验仪器
本研究所使用的气质联用仪具体信息如下：Agilent 7890 GC（气相色谱），Agilent 5975B MS (Agilent, USA)（质谱），HP-Innowax 60 m×0.25 mm×0.25 μm (J & W scientific, USA)（毛细管柱）。
2 方法
2.1 游离态果香香气物质提取
葡萄果实样品香气物质的提取参考本实验室已有的方法进行(Xu et al., 2015b)。取约50 g葡萄果实，迅速除去果梗，用液氮速冻并去籽后，加入0.5 g D-葡萄糖酸内酯（抑制糖苷酶活性）和1 g PVPP（去除多酚、防止样品氧化），迅速粉碎至粉末。将粉末置于50 mL 离心管中，在4°C冰箱中静置浸渍4 h 后，在4°C、8000 rpm 下离心10 min，得到澄清葡萄汁用于SPME 及GC-MS分析。
2.2 SPME-GC-MS香气分析条件
取5 mL葡萄汁、1.00 g氯化钠和10 μL内标（4-甲基-2-戊醇，1.0018 g/L）置于15 mL样品瓶中，迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子拧紧。SPME萃取头（50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS, Supelco, Bellefonte, PA., USA）与CTC CombiPAL 自动进样器（CTC Analytics, Zwingen, Switzerland）相连，可以进行自动化的顶空固相微萃取。样品瓶先被移至加热/搅拌装置中，在40 °C下加热搅拌30 min，搅拌速度为500 rpm。然后将已活化SPME萃取头插入样品瓶的顶空部分，在40 °C下继续加热搅拌30 min后，取出SPME萃取头，立即插入GC进样口在250 °C 条件下解析8 min。
根据实验室先前研究，设定气相色谱质谱联用仪的条件如下：载气：流速为1 mL/min的高纯氦气；顶空固相微萃取采用不分流模式自动进样，在气相色谱进样口热解析8 min，保持温度为250 ℃，；升温程序为50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min升温至220 ℃，保持5 min。质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，电离方式为EI，电离能为70 ev。
2.3 香气物质定量定性分析
利用自动化质谱图解卷积和鉴定软件（AMDIS）计算得到保留指数和质谱信息，其中化合物的保留指数是通过分析相同色谱条件下C6-C24正烷烃保留指数计算得到。具体公式如下：
其中，I为保留指数，，，分别代表组分及碳数为n，n+1正构烷烃的保留时间。
通过质谱分析结果与NIST11标准谱库匹配检索，以及本实验室研究得到的化合物标准保留指数鉴别化合物。如果实验室数据中没有化合物标准保留指数，暂定的化合物是通过NIST11标准谱库和文献报道过的保留指数而确定的。
在先前研究的基础上，经过优化分析方法对化合物进行定量。根据葡萄果汁糖和酸的含量，配制1 L含7 g/L酒石酸和200 g/L葡萄糖的葡萄模拟水溶液，并将用1 mol/L的NaOH溶液调pH至3.4。用乙醇（色谱纯）将每个标准品溶解，然后将所有标准品溶液混合，并将混合液用混合基质稀释成连续的20个浓度水平。在与葡萄果汁样品相同的条件下，提取并分析每个浓度水平的香气标准曲线。通过建立葡萄果实香气物质标准曲线（横坐标：香气化合物标准品与内标4-甲基-2-戊醇的峰面积比，纵坐标：该香气化合物标样的浓度），对相关香气化合物定量分析，其中所有标准曲线的相关系数均大于97%（表1和表2）。除此之外，其他没有标准曲线的化合物通过相似结构的化合物或者碳原子数相似的化合物的标准曲线进行定量分析。
3 结果
3.1 色谱条件
根据实验室先前研究，设定的气相色谱质谱联用仪的条件上节所示。
本研究采用Scan和Sim/Scan两种方法对相同标准品或葡萄果实进行分析检测，两种方法质量扫描范围具体信息如下：
（1）Sim/Scan法，其中Scan法是对所有离子碎片进行扫描（20-350 u质量扫描范围），而Sim法则是在质谱扫描过程中，仅扫描设定好的部分离子碎片。本文Sim法选择的离子碎片如下：
第一组（1 min-30 min）：59,68,69,93,121,136
第二组（30 min-46 min）：43,69.142
第三组（46 min-结束）：43,92,119,120,128,135
（2）Scan法质量扫描范围：20-350u。
3.2 线性范围、检出限与定量下限
本研究检测25种标准品果香物质，其中21种酯类化合物，2种呋喃类化合物，2种苯环类化合物，1种吡喃类化合物。如表3所示：通过对比Scan法和Sim/Scan法的检测结果可以发现，Scan法化合物的线性范围明显比Sim/Scan法化合物的线性范围窄。从表3中可见：呋喃酮Scan法线性范围在1031200-64450 μg/L，而在Sim/Scan法中的线性范围为1031200-251.76 μg/L；邻氨基苯甲酸甲酯在Scan法中的81600-9.96 μg/L，而Sim/Scan法检测到的线性范围为81600-1.25 μg/L；甲氧基呋喃酮的线性范围在Scan法中为162400-39.65 μg/L，而在Sim/Scan法中则为20300-2.48 μg/L。另外，化合物的检出限也在两种检测方法中具有明显的差异性，例如呋喃酮的检出限从Scan法到Sim/Scan法，从16112.50 μg/L降到15.73 μg/L；邻氨基苯乙酮在Scan法和Sim/Scan法中检出限分别为14.45 μg/L和0.45 μg/L；邻氨基苯甲酸甲酯在Scan法中的检出限为4.98 μg/L，而在Sim/Scan法中检出限仅为1.25 μg/L；甲氧基呋喃酮Scan法和Sim/Scan法中检出限分别为9.91 μg/L和1.24μg/L。但是由于本研究中Sim/Scan法采用两种扫描方法结合的方式进行扫描，因此单位时间内对其他碎片的扫描次数减少，所以某些化合物的检出限也会因此增加，例如己酸异戊酯在Scan中的检出限为0.02 μg/L，而在Sim/Scan法中检出限则为0.12 μg/L。
3.3 实际样品的检测
本研究对五个葡萄果实中的果香物质进行了检测验证，也同样采用Scan法和Sim/Scan法两种检测方法（表4）。呋喃酮在秋蜜和大平地拉洼品种中，采用Scan法未检测到，而采用Sim/Scan法中检测到的浓度分别为1136.96 μg/L和621.42 μg/L；甲氧基呋喃酮在秋蜜品种中，采用Sim/Scan法中检测到了14.05 μg/L的含量，而Scan法中未检测到该化合物。
本研究采用Scan和Sim/Scan两种方法对25种标准品果香物质进行分析检测，其中包括21种酯类化合物，2种呋喃类化合物，2种苯环类化合物，1种吡喃类化合物，结果显示Sim/Scan法明显降低果香物质检出限，扩大果香物质的检测的线性范围。
本研究通过Scan和Sim/Scan两种方法对葡萄果实中果香物质进行了对比分析检测：Sim/Scan法降低了呋喃酮、甲氧基呋喃酮、邻氨基苯乙酮和邻氨基苯甲酸甲酯在葡萄果实中的检出限，并扩大了其线性范围。
