果实病害防控岗位

  1.研究方法

  1.1 GLB191对葡萄灰霉病菌的抑制作用

  GLB191对葡萄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的影响：采用抑菌圈法中的打孔法测定菌株GLB191不同浓度的发酵液对葡萄灰霉菌菌丝生长和形态的影响。取 100 L×105 个/mL 灰霉菌分生孢子悬浮液滴加于 PDA 培养基上，用涂布棒均匀涂布，再用 6 mm 无菌打孔器在平板中心打孔，分别加入 50 L 菌株 GLB191发酵液的不同稀释倍数的处理液，加入无菌水的平板为对照。25 ℃培养箱中培养 5 d，重复 3 次。采用十字交叉法测量抑菌圈的直径。挑取抑菌圈边缘的菌丝于光学显微镜下观察菌丝的形态变化。

  分生孢子萌发抑制试验：在含有 105孢/mL 灰霉菌分生孢子悬浮液的试管中，分别加入菌株GLB191发酵液的原液、10倍、100 倍和500倍稀释液，充分混匀后，将各处理的孢子悬浮液置于 22 ℃ 的光照培养箱，黑暗条件下培养，8 h 后观察孢子的萌发情况，３次重复，每个重复计数３个视野区域共约 100 个孢子，于光学显微镜下观察孢子萌发情况，计算各处理的孢子萌发抑制率。孢子萌发抑制率（%）＝（对照组孢子萌发率－处理组孢子萌发率）/对照组孢子萌发率×100。

  离体果实接种试验：采用刺伤法测定菌株发酵液对葡萄果实灰霉病防效，用无菌 接种针在红提葡萄果实中间位置刺出伤口，然后在每个果实的伤口处分别接入 2L、 2×105 孢/mL 灰霉菌孢子悬浮液，室温放置 30 min 晾干果实后，再接入GLB191发酵液的原液 4 µL，3 次重复，共接种30粒果实，以无菌水为对照。然后将各处理的果实分别置于塑料保鲜盒中，喷雾保湿，置于 22 ℃气候培养箱。放置 9 d 后，采用十字交叉法统计病斑直径，并计算各处理的 病斑抑制率。病斑抑制率（%）＝（对照组病斑直径－处理组病斑直径）/（对照组病 斑直径×100）

  1.2 GLB191在葡萄叶片上的定殖动态

  （1）叶面喷雾处理

  选择温室栽培生长状态良好且一致的葡萄植株9株，每个处理3株(每1株苗为一个重复，3次重复)，用1×107CFU/ml的芽胞杆菌GLB191-78进行叶片喷雾处理，至叶片表面形成密集水雾却不流下为止，无菌水作对照。在接种后0、3、5、7、10、14、20、26和31 d取处理植株生长状态一致的叶片，电子天平称量并记录其重量。将叶片置于盛有300ml无菌水的三角瓶中，在超声波震荡仪中震荡消洗10 min.尽量将表面细菌清洗下来。取出叶片后，将叶片置于75%酒精中消毒1 min，再用2%的次氯酸钠溶液表面消毒2-5 mm，然后用无菌水冲洗4次。取出叶片，吸干水分后放到研钵中，研磨成匀浆。将超声波洗涤液和叶片匀浆转移到无菌试管中，用无菌水进行10倍系列操度稀释。超生震荡洗涤液稀释1000倍，叶片匀浆稀释100倍。分别取稀释后菌悬液100增到有抗生素的LB平板(TetR)中，均匀涂布后用封口膜封好，同时把最后一次漂洗的无菌水以及对照不接菌的叶片匀浆涂到同样的抗性平板上检查是否有菌落出现，放到37℃的培养箱中倒置培养24 h后计数。每个处理设3个重复，选取菌落数在30~300个范围内的平板，统计每皿菌落的个数，根据公式，计算表面细菌数量和平均每克叶片(鲜重)内标记细菌的数量。

  （2）灌根处理

  选取生长状态良好且一致的盆栽植株9株，进行灌根处理，每个处理3株植物，灌根接种50ml浓度为1X107CFU/ml菌悬液。接种后的植株继续于25℃光照培养箱培养。在接种1、2、4、8、10、15和20 d 后采取植株由下向上数第二片叶子和由上向下第二片叶子进行菌株回收，方法同上述一样。根、茎和叶部细菌定殖部位检测分别在灌根处理5、10和20 d后，拔出盆栽葡萄幼苗，取幼苗的一段主根，用无菌水冲洗两次，冲去附着在根表面的细菌。将根置于载玻片上，用刀片徒手横切获得根部横切切片，滴一滴无菌水于根部切片上，盖上盖玻片，置于CLSM下，在波长488mm的激发光照射下，由低倍到高倍观察细菌所在位置并拍照(1棵植株为一个重复，3次重复)

  1.3 GLB191及其突变菌株对葡萄灰霉病菌的生防效果

  将葡萄果实浸泡在 GLB191、ΔxynA、ΔxynC 和ΔxynD 摇培 48 小时的菌液中，等待 30 分钟后拿出置于培养皿中，以 LB 液体培养基、H2O 处理为对照。将放有处理后葡萄果实的培养皿置于垫有四层湿纱布的保鲜盒中，密封保湿，25℃培养 24 小时，光周期为 12 h 光照、12 h 黑暗。用无菌接种针在葡萄果实中间位置刺出约2 mm 深的伤口，在伤口处接入 5 µL 5×105 个/mL 灰霉菌孢子悬浮液。将处理完果实放入开盖培养皿中，置于垫有四层湿纱布的保鲜盒内，密封后置于 22℃气候培养箱中。培养 3 d 后，用十字交叉法测量病斑直径，拍照记录。

  2 结果与分析

  2.1 GLB191对葡萄灰霉病菌的抑制作用

  （1）菌株发酵液对灰霉病菌菌丝的抑制作用

  如图显示GLB191发酵液处理在不同浓度下对灰霉菌丝生长都有明显的抑制作用。菌株发酵液不仅抑制菌丝生长，而且能够改变菌丝的形态，使其畸形扭曲，对照组的菌丝粗壮、均匀一致，经过菌株发酵液处理后的菌丝膨大扭曲，粗细不均匀。

  （2）菌株对灰霉病菌分生孢子萌发的影响

  随着发酵液稀释倍数的增大而抑制灰霉孢子萌发作用减弱。

  （3）离体果实接种防效

  采用刺伤法测定菌株发酵液对葡萄果实灰霉病防效，发现GLB191菌株发酵液处理组的葡萄果实，灰霉病的发生程度显著降低，葡萄果实仅在接种点处出现少量菌丝和孢子，尚未出现严重的坏死性病斑，病斑面积和坏死程度明显轻于对照组，病斑抑制率为55.48%。

  2.2 GLB191在葡萄叶片上的定殖动态

  （1）叶面喷雾处理

  从图可知，在接种后的30 d内，芽胞杆菌GLB191-78叶片表面定殖数量一直保持在107CFU/g·fw之上；在叶片内部定殖数量稳定在106CFU/g·fw左右。以上结果表明，菌株GLB191-78能在葡萄表面和内部稳定定殖，且有很强的定殖能力。

  （2）灌根处理

  如图显示，芽胞杆菌GLB191-78灌根处理8 d 后，可在植株的下部叶片分离检测到供试菌株。处理半个月后，GLB191-78菌量稳定在103CFU/g·fw左右。以上结果说明芽胞杆菌GLB191-78能够通过根部进入植株并向植株地上部分转移。

  CLSM观察结果显示，菌株GLBI01-78灌根处理10 d天后，在根内皮层薄壁细胞和中柱导管、叶柄维管束导管、叶脉和叶片中观察到绿色荧光，叶片中荧光主要聚集在海绵组织与栅栏组织之间。以上结果表明菌株能够从根部进入植株，并可以在植株内由根部向地上部分进行转移。

  2.3 GLB191及其突变菌株对葡萄灰霉病菌的生防效果

  如图显示，病原菌接种后 2 d，果实开始发病，3 d 后的病斑直径统计结果显示，GLB191 处理的果实病斑直径显著低于对照组 (PDB 和水处理)，ΔxynA、ΔxynC、ΔxynD 和 ΔlytD 处理的果实病斑直径显著高于 GLB191。说明 GLB191 对灰霉病菌有良好防效，xynA、xynC、xynD 和 lytD 均在 GLB191 防治灰霉病中发挥作用。