酿酒微生物岗

刘延琳

 

  摘要: 蛋白质浑浊是葡萄酒非生物不稳定性的显著缺陷，酸性蛋白酶能够在pH2.5～4.5的酸性条件下催化水解蛋白质，生成氨基酸和多肽，被广泛用于酒精发酵、啤酒、果酒澄清等工业。本研究通过酿酒酵母表面展示系统中的启动子和锚定蛋白的作用在酿酒酵母细胞表面表达酸性蛋白酶。将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)酸性蛋白酶基因(pepA)克隆，利用同源重组定点整合到酿酒酵母的基因位点，成功获得单倍体和二倍体两株可通过细胞表面展示表达酸性蛋白酶的酿酒酵母，最高酶活分别是285.71U/mL和495.24U/mL。研究可为解决葡萄酒中蛋白浑浊的问题提供新思路，为实现pepA酸性蛋白酶全细胞催化剂工业化应用奠定理论基础。

 

  关键词: 酸性蛋白酶；酵母表面展示；蛋白沉淀；酿酒酵母；稳定性

 

  酸性蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，一种极具有丰富的化学和物理性质的化合物。其活性位点中心含有一个或更多的羧基，能够在酸性介质（pH<4.5）中有效地水解蛋白质。这类酶具有极强的耐酸性，在水解过程中不会因微生物的滋生繁殖而腐败变质，被普遍应用于食品，酿造等各个工业中。工业上的酸性蛋白酶可被大量的真菌产生分泌，有研究表明担子菌也可分泌产生酸性蛋白酶，原核生物中酸性蛋白酶比较罕见。蛋白酶可依据活性位点上官能团的差异，通常被分为四种类型：含硫类氨基酸Cys的蛋白酶，富含羟基类氨基酸Ser的蛋白酶，富含酸性氨基酸Asp的蛋白酶和金属蛋白酶。对于天冬氨酸(Asp)蛋白酶而言，其等电点大致为3.0-5.0且分子量大约是30-40千道尔顿，最大的酶活性体现位于酸性介质中，因此被称为酸性蛋白酶。

 

  啤酒、白酒和酱油的酿造等与食品相关的各大生产工业，常用酸性蛋白酶作为蛋白澄清剂。在啤酒发酵糖化阶段利用酸性蛋白酶可降解底物麦芽中的蛋白质，通过添加适量的酸性蛋白酶可阻止啤酒遇冷浑浊的现象。有研究报道在白酒酿造的过程中，酸性蛋白酶可以溶解发酵原料和辅料的成分，促进酒精的发酵，同时降解微生物残体，赋予白酒香气物质。蛋白质与其他物质形成的复合物是组成葡萄酒的物理化学特性的重要指标，但白葡萄酒中来自于发酵原料和辅料的非稳定蛋白质，会对葡萄酒的香气质量造成不良影响。针对白葡萄酒蛋白沉淀问题，传统方法是在发酵或陈酿过程利用明胶和膨润土，虽然可以去除蛋白沉淀，但是下胶的过程会将葡萄酒中部分稳定性蛋白去除，影响葡萄酒的香气质量。使用蛋白质酶解法可将葡萄酒中蛋白质水解成小肽，同时会对酒液补充部分氨基酸，可使葡萄酒获得良好的澄清度和稳定性，提高葡萄酒的营养价值。如今可利用分子生物学发展的平台，通过基因工程改造酵母菌使其分泌酸性蛋白酶在发酵过程中水解不稳定的蛋白质，达到改善白葡萄酒的感官品质，解决蛋白沉淀的目的。

 

  本研究以宇佐美曲霉(A. usamii)为酸性蛋白酶基因(pepA)供体，利用酵母细胞表面展示技术(如图1)，将宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因pepA整合到酿酒酵母的基因位点，以期在酿酒酵母发酵的过程中，将不稳定蛋白质水解成氨基酸和小肽，旨在解决白葡萄酒中蛋白浑浊的问题同时为酵母的生长提供可吸收性氮源。

 

 

 

  1 材料与方法

 

  1.1 料

 

  1.1.1 菌株与质粒

 

  本研究所用的宿主菌为酿酒酵母单倍体S. cereviviae BY4741，在武汉淼灵生物科技有限公司购买(his3Δ1，实验室改造后为SD-Ura缺陷性酵母)和酿酒酵母二倍体S. cereviviae 82-9-35(实验室前期分离得到，his3Δ1，为SD-Ura缺陷性酵母)。生工生物工程公司合成含宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因pepA的大肠杆菌，利用来自宝生物官网Phanta @ Turbe Super-Fidelity DNA Polymerase扩增体系，进行PCR扩增目的片段pepA基因,后利用Takala公司生产的试剂盒直接纯化回收。E.coli DH5α购买于天根生化科技(北京)有限公司，质粒为本实验室保存于大肠杆菌的质粒载体PUC-GAP-α-factor-HQM-SED1。

 

  1.1.2 工具酶与主要试剂

 

  0.4 mol/L碳酸钠溶液、乳酸缓冲液（pH3.0）、0.4 mol/L的三氯乙酸、0.5 mol/L的氢氧化钠、10.00 mg/mL酪素溶液、100 μg/mL酪氨酸标准溶液、1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）（pH 8.0）、TE缓冲液（Tris-EDTA buffer solution）、氨卡青霉素(Amp)、1 mol/L山梨醇、酵母感受态制备处理液、酵母全营养培养基（YPD）、尿嘧啶缺陷型合成葡萄糖基础培养基（SD-URA）、Luria-Bertain（LB）培养基和LB-Amp培养基的配制方法参照Zhang等(2019)的方法。In-Fusion HD Cloning kits、DNA凝胶纯化试剂盒、SD-Ura DO Supplement、Premix Taq™ (Ex Taq™ Version 2.0 plus dye)、DNA Markers和DNA 限制性内切酶(Cla I、Sph I、Sma I)购于宝生物（大连）有限公司；Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase购于南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA提取液（酚∶氯仿∶异戊醇=25：24：1）、1 mol/L 二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）、DNA纯化试剂盒和酵母基础氮源（YNB）购于北京索莱宝科技有限公司；引物的合成和DNA 测序交由上海生物工程有限公司完成。

 

  1.1.3 引物与pepA序列

 

 

  1.2 方法

 

  1.2.1 pepA基因的合成和TFP6因子表达载体构建

 

  pepA基因通过NCBI查找相应序列并进行优化，由生工生物工程公司合成，利用Phanta @ Turbe Super-Fidelity DNA Polymerase（体系参照宝生物官网）扩增pepA基因片段上游引物pepA-F: AGAGAGGCTGAAGCTATCGATATGGTCGTCTTCAGCAAAACCGCT；下游引物pepA-R: CAGAACCACCACCACCGCATGCAGCCTGAGCAGCAAAGCCCAGCTT，后用试剂盒直接纯化回收；TFP6载体PUC-GAP-α-factor-HQM-SED1用快切酶Sph I 和Cla Ⅰ双酶切，试剂盒直接纯化回收；用一步克隆的方法（操作方法参照宝生物In-Fusion RHD Cloning Kit说明书）连接目的基因片段和线性化质粒载体。具体操作步骤参照OMEGA质粒提取试剂盒和天根的DNA纯化回收试剂盒。

 

  1.2.2 大肠杆菌转化

 

  一步克隆连接的表达载体转化入E.coli DH5α(购自于宝生物)，涂布在LB-Amp固体平板上，37 ℃培养12-14 h，挑取单菌落用Taq酶体系（参考宝生物）进行菌落PCR验证，引物为pepA-F和pepA-R。将验证成功的大肠杆菌单菌落接种在LB-Amp液体培养基中，37 ℃、180 rpm振荡培养12 h。

 

  1.2.3 目标酶基因插入酵母基因组

 

  OMEGA质粒提取试剂盒提取大肠杆菌中含有pepA的重组质粒，用DNA限制性快切酶Sma Ⅰ单酶切后，进行试剂盒纯化回收。将回收后的DNA片段，转化至SD-Ura缺陷性酿酒酵母单倍体BY4741和二倍体82-9-35(目标酶片段依靠His3组氨酸同源臂与酵母基因组发生同源重组），后涂布在SD-Ura平板上，30℃恒温培养48 h，挑取酵母单菌落进行酵母菌落PCR验证重组酵母。Taq酶体系PCR验证引物：上游引物为His-f: GCGTACCACCACCATTACACATGT，下游引物pepA-R:CAGAACCACCACCACCGCATGCAGCCTGAGCAGCAAAGCCCAGCTT。

 

  1.2.4 pepA信号肽预测

 

  在网址 http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/进行pepA的氨基酸序列的信号肽预测。

 

  1.2.5 酸性蛋白酶酶活测定

 

  酶活力单位的定义和酶活的测定方法和计算公式参照郑东影（2020）的方法。

 

  2 结果与分析

 

  2.1重组质粒的构建

 

  根据NCBI网站中宇佐美曲霉(A. usamii)的酸性蛋白酶基因(pepA)序列，在Vector NTI软件设计扩增pepA目的基因的引物，引物为pepA-F和pepA-R。pepA基因由生工生物工程公司合成，进行高保真酶PCR后，直接用试剂盒纯化回收，得到片段为1182bp的目的片段，送去测序该片段与NCBI网站目的基因pepA序列一致。出发质粒PUC-GAP-α-factor-HQM-SED1用快切酶Sph Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切，直接用试剂盒纯化回收，得到TFP线性质粒载体；用一步克隆的方法（操作方法参照宝生物In-Fusion RHD Cloning Kit说明书）连接目的基因片段pepA和线性化质粒载体。具体操作方法参照OMEGA质粒提取试剂盒和天根的DNA纯化回收试剂盒。提取大肠杆菌重组质粒测序，引物为cexu-GAP-f和pepA-R，测序结果与预期一致。

 

 

  2.2 电激转化酿酒酵母

 

  参考谢文平(2015)的方法制备酵母感受态并进行酵母电转化。将转化子划线在YPD和SD-Ura平板上，恒温30 ℃，培养48小时后，进行菌落PCR验证，验证引物为cexu-GAP-f、his-f和pepA-R。

 

 

 

  由图7可知，在培养温度30℃的条件下，酿酒酵母表面展示的酸性蛋白酶在96h内的酶活曲线图，其72h左右出现最高酶活，在72h内之前随着酵母培养时间的酶活呈现上升的趋势，但在72h后酸性蛋白酶的活性随时间呈现下降的趋势，并且82-9-35-8的酶活在96h内基本高于BY4741-i；推测其酶活下降的原因可能是由于酵母培养基中营养物质被酵母消耗减少，酵母自身生长能力下降造成，其在72h之前酶活上升的原因与酵母在72h内繁殖增长相关，82-9-35-8的酶活在96h内基本高于BY4741-i的原因可能是由于二倍体自身原因造成。

 

  2.4 监测阳性重组菌的生长

 

  重组酵母和宿主菌（BY4741 和 82-9-35）分别在 SD-ura 和 YPD 上划线培养，48 h 后挑取单菌落接种到 50 mL 的 SD-URA 选择性液体培养基和 YPD 液体培养基中，30℃、200 rpm 培养 48 h 进行活化后，血球计数板进行活菌计数，以 1×106 CFU/mL 的接种量接种至 150 mL 的 YPD 液体培养基中，培养条件 30℃、200 rpm，每隔 12 h 取样，用酶标仪测定其在 600 nm 下的吸光度值，以生长时间为横坐标，OD600 为纵坐标，绘制出重组酵母菌株和对照菌株的生长曲线。

 

 

  用 YPD 液体培养基培养重组酵母和原菌株，每隔 6 h 取样在 600 nm 下测定吸光度，绘制重组酵母与对照菌株的生长曲线，如图 8所示。0~24 h 时，所有菌株都处于生长延滞期。24 h 后所有菌株开始迅速繁殖，30 h~54 h 是所有酵母的生长对数期，对数前期，二倍体菌株的生长比单倍体快；对数后期，单倍体的生长速度超过二倍体，最终单倍体的生长量高于二倍体；而且表面展示 pepA 的二倍体重组酵母在稳定期达到的生长量明显比原菌株高，结果表明单倍体和二倍体酵母表面展示 pepA 并没有对菌株的生长有不良影响，且显著增强了菌株生长能力。

 

 

  如图9所示当阳性转化子BY4741-i和82-9-35-8在 YPD 培养基上的生长进入平衡期前，细胞数量积累达到很多，酶活在此时期剧烈上升，并在细胞生长处于平衡期时酶活基本达到最大值；在72h左右酶活达到最大值，72h后酶活呈现下降的趋势，推测由于培养基营养物有限，细胞相互间竞争，死亡的细胞数和新生的细胞数持平，酶活曲线呈下降趋势。

 

  3 讨论

 

  目标蛋白转录翻译的过程受到代谢途径的影响。在酿酒酵母中，异源蛋白的分泌和表达过程与其他真核生物基本相同如图10所示。从核糖体开始mRNA被翻译成新的肽链，并被转运至高尔基体，高尔基体对多肽链存在进一步加工和修饰的作用，最终通过囊泡运输的作用被分泌到细胞外部。如果蛋白质折叠错误，内质网将重新折叠或开通蛋白质降解途径使其分解。当错误的蛋白质不能及时修复并积累时，会导致宿主细胞的凋亡。在分泌表达的过程中，正确的蛋白未被及时送出胞外则会在胞内积累，导致其活性降低甚至被降解，所以囊泡运输的过程是影响蛋白分泌表达效率的重要限制性因素之一。当前研究主要使用融合伴侣包括反式伴侣和顺式伴侣，增强目标蛋白的折叠运输效率，如依靠筛选CIS伴侣蛋白可提升蛋白的正确折叠程度。信号肽引导目标蛋白的具有的作用，其编码区由17到30个氨基酸残基序列组成，一般是10个带正电荷的非极性氨基酸。大多数表面展示的宿主细胞其目标蛋白的表达通常以包涵体的形式存在，并不是直接的分泌表达，包涵体是不具有蛋白活性的。信号肽被用来解决包涵体重折叠的影响，引导外源蛋白在细胞特定位置的分泌。目标蛋白的信号肽与宿主细胞的融合性存在一定的差异，其不恰当使用会对目标蛋白的分泌途径造成负面影响。有研究报道当宿主细胞的二氨基肽酶对信号肽去除不完整时，也会影响目标蛋白的活性。基于以上因素为了确保从表达盒产生的包含酸性蛋白酶的融合蛋白能够通过细胞机制正确地定向到细胞表面，本研究引入了α-factor信号肽，采用翻译融合伴侣TFP6因子。

 

 

  连接肽的设计要确保得到正确构象的融合蛋白时，也要保证融合蛋白又能保持正常的分泌和表达，否则会对目的蛋白的活性造成影响。鉴于存在的不利影响，本研究选择的是具有柔韧性，亲水性，易折叠性和小侧链氨基酸的接头肽序列（（G4S）3），在一些酵母展示载体（例如，pYD1 和 pYD5）中具有编码这种类型连接肽的序列。

 

  展示效率同时应考虑要展示的蛋白质的分子量，其性质将会影响融合蛋白在细胞内外的转运和分泌，Fan 等人（2012）在分析解纤梭菌 DSM 5812 支架 II 的几个重复单元的试验中，揭露随着 174 个氨基酸重复序列的增加，暴露 Aga2-C 端融合蛋白的细胞的百分比下降，作者认为每个细胞的表面积是有限的，在展示较大蛋白的菌株中观察到重组质粒的不稳定性。Yang等使用Pir 蛋白时，发现很难展示800个以上氨基酸的蛋白。所以要科学选择目标蛋白，同时选择其与锚定蛋白的合适的融合方式。锚定蛋白存在与酵母细胞壁不同的结合方式，会影响目标蛋白的展示量和表达活性。Yamada 等人（2011）报道，当表面展示纤维素酶的工程酵母菌株通过交配进行二倍化并评估其乙醇发酵性能时，观察到乙醇产率增加约 2.5 倍，所以本研究进行了宿主二倍体优化，阳性二倍体菌株酸性蛋白酶酶活是阳性单倍体菌株酶活1.7倍左右，这是由于与单倍体菌株相比，二倍体菌株具有更高的细胞生长速率，细胞产量和对各种胁迫的耐受性。

 

  4 结论

 

  本次研究通过克隆宇佐美曲霉(A. usamii)的酸性蛋白酶基因(pepA)，以SED1为锚定蛋白，GAP为启动子成功搭建了酿酒酵母a-凝集素表面展示系统，获得可通过酵母细胞表面展示技术表达酸性蛋白酶的两株酿酒酵母，分别是单倍体BY4741-i和二倍体82-9-35-8；监测重组酵母的生长发现，表面展示pepA并没有对宿主菌株造成代谢压力而对其生长造成不利影响，发现重组酵母的最高酶活性表达时间与其生长进入稳定期时间基本一致。依据重组酿酒酵母酸性蛋白酶的活性表现，进而证明了酿酒酵母表面展示技术可作为葡萄酒介质低pH条件下的全细胞生物催化剂，在改善白葡萄酒的蛋白稳定性方面的具有可行性。