鲜食葡萄品种改良岗位

  1 材料与方法

  1.1 材料

  本研究果实材料为玫瑰香与红地球的杂交后代果实。田间采样地点位于北京市平谷区马昌营镇前芮营村（北纬40°13′，东经117°12′），采样时间为2017-2018年。葡萄园采用简易避雨、地表覆盖园艺地布和滴灌供水管理模式，机械埋土越冬。香气检测实验在北京市林业果树科学研究院进行。

  1.2 试验方法

  在杂种单株后代植株上采集成熟果实，兼顾阴阳面、叶幕层内外和上中下果穗，在每穗葡萄果实肩、中、顶部随机采取葡萄果实80～100粒，重复3次。所有葡萄果实随即用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱保存。采用数显糖度计（Atago，PAL-1）测定可溶性固形物（TSS），读取5个数据；0.1 mol.L-1 NaOH滴定法测定可滴定酸，3次重复。

  1.3 游离态香气成分样品制备

  游离态：将放置于-80℃超低温冰箱中的葡萄果实取出，称量50 g用于香气提取分析。用液氮迅速冷冻，剪掉果梗、去籽；之后加入0.5 g D-葡萄糖酸内酯，抑制糖苷酶活性，加入2 g交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)防止样品氧化，将葡萄果实打碎成粉末，均匀混合后转移到50 mL离心管中，在室温条件下静置2 h；随后进行离心，转速为8000 r min-1，时间为10 min，离心后将上清液转入50 ml离心管中，取5 ml果汁用于进样及GC-MS分析，每个样品做两个技术重复。剩余果汁于-80超低温℃冰箱中冻存。

  1.4 气相色谱与质谱联用（GC-MS）条件

  顶空固相微萃取（HS-SPME）方法萃取香气成分参考张明霞的方法。称取1.00g NaCl加入15 mL的样品瓶中，加入磁力转子，准确量取5 mL样品放入样品瓶中，加入10μL内标(4-甲基-2-戊醇，1.0388 g/L)后，迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的样品瓶盖拧紧后置磁力搅拌加热台上，在40℃下保持30 min，然后将已活化或热解析过的SPME萃取头插入样品瓶的顶空部分，萃取头距离液面1 cm。在40℃加热搅拌条件下，吸附30 min，使样品瓶中的香气成分在液体中、顶空和SPME萃取头三相中达到平衡，取下萃取头，立即插入GC进样口在250℃条件下热解析8 min。每个样品做两个独立的重复。

  1.5 单萜化合物定性定量分析

  利用质谱全离子扫描（Scan）图谱，对于已有标样的香气物质，依据已建立的相同色谱条件下该化合物的保留指数和质谱信息进行定性分析。没有标样的香气物质，利用文献报道中相似色谱条件下该化合物的保留指数以NIST 05标准谱库比对结果进行半定性分析。对于文献中未报道的相似色谱条件下化合物保留指数的香气物质，则根据NIST 05标准谱库比对结果进行半定性分析。

  根据葡萄果实中糖、酸含量，用蒸馏水配制含7 g/L酒石酸和200 g/L葡萄糖的乙醇（1%, v/v）溶液1 L作葡萄果实模式溶液，并用1 M NaOH调pH至3.4。按照葡萄果实样品各类香气化合物的浓度水平，分别称取不同量的已有香气化合物标样用乙醇溶解，将各类香气标样溶液混合配制标准母液，连续梯度稀释15个不同浓度，建立葡萄果实香气物质标准曲线（香气化合物标样与内标化合物质4-甲基-2-戊醇的质谱选择离子扫描的峰面积比/该香气化合物标样的浓度）。对于已有标样的香气物质利用其相应的标准曲线来进行定量，没有标样的香气物质利用化学结构相似，碳原子数相近的标样香气物质的标准曲线进行半定量。

  1.6 数据处理与统计分析

  数据的差异显著性分析、回归分析和主成分分析通过数据分析软件SPSS 16.0完成；绘图采用绘图软件Origin 8.0。

  2 结果

  2.1 单萜烯的含量与变化

  从表1中可以看出，玫瑰香和红地球这两个亲本中，玫瑰香的单萜烯含量远远高于红地球的含量，玫瑰香中单萜烯总含量为145.17μg/L，约为红地球单萜烯总含量的3倍。这也表明在玫瑰香型葡萄中单萜烯的含量较高，玫瑰香气味浓郁。在玫瑰香中，月桂烯的含量最高，为50.65μg/L，能检测到α-衣兰油烯，但是在玫瑰香中其含量极低，为0.52μg/L，可以看出在葡萄中呈香单萜烯的含量差异很大。红地球属于非玫瑰香型的葡萄，其中我们检测到含量最高的单萜烯也是月桂烯，为8.84μg/L，可见月桂烯在玫瑰香和红地球这两种葡萄中很重要。

  子代中，主要以月桂烯、柠檬烯、β-trans-罗勒烯和β-cis-罗勒烯含量较高，其中月桂烯的含量最高，为18.45μg/L，依次是β-cis-罗勒烯含量为13.42μg/L，β-trans-罗勒烯含量为11.55μg/L。其中，含量最低的是α-衣兰油烯，其含量为0.45μg/L。2014和2015两年内子代中单萜醇的含量变化不大。

  2.2 单萜醇的含量与变化

  2014年玫瑰香亲本中没有检测到trans-异香叶醇，能检测到9种单萜醇。在红地球中，没有检测到氧化橙花醇、trans-异香叶醇和cis-异香叶醇，而且与玫瑰香相比，红地球中单萜醇的含量均较低。在亲本玫瑰香中含量最高的是香叶醇，其含量为795.88μg/L，其次是γ-香叶醇、橙花醇、氧化橙花醇和里那醇；在红地球中含量最高的是橙花醇，其含量为49.36μg/L，其次是香叶醇和松油醇，红地球中单萜醇的含量均偏低。子代中表现出典型数量特征的是香叶醇、橙花醇、氧化橙花醇和里那醇，其中香叶醇的含量最高，为133.48μg/L，是最主要的单萜醇；其次是橙花醇，其含量为31.89μg/L，相比于香叶醇，其他单萜醇的含量都很低。相比于亲本来说，子代中单萜醇的含量明显降低，呈现典型数量的特征。

  2.3单萜醛的含量与变化

  亲本和子代中均检测到了3种单萜醛，即香叶醛、橙花醛和香茅醛。可以很明显的看出，在亲本玫瑰香中，单萜醛占游离态单萜总量的41.2%，是主要的游离态单萜的组成。玫瑰香中含量最高的单萜醛是香叶醛，其含量为640.45μg/L，其次是橙花醛，含量为538.87μg/L，最后是香茅醛，含量为249.50μg/L。红地球中含量最高的是香茅醛，其含量为194.24μg/L，其次是橙花醛，其含量为175.06μg/L，最后是香叶醛，含量为52.99μg/L。玫瑰香中单萜醛的含量远远高于红地球中单萜醛的含量。子代中，含量最高的是橙花醛，为196.04μg/L，其次是香叶醛和香茅醛。从单萜醛在亲本和子代中变化情况来看，子代的含量接近于亲本红地球。

  2.4单萜醚的含量与变化

  在玫瑰香中检测到了4种单萜醚化合物，即cis-氧化玫瑰、trans-氧化玫瑰、cis-呋喃型氧化里那醇和trans-呋喃型氧化里那醇。但是在红地球中只检测到cis-呋喃型氧化里那醇和trans-呋喃型氧化里那醇，没有检测到氧化玫瑰，而且红地球中单萜醚的含量很低。在玫瑰香中，cis-氧化玫瑰的含量最高，为102.29μg/L，其次依次是trans-氧化玫瑰、cis-呋喃型氧化里那醇和trans-呋喃型氧化里那醇。相比于亲本玫瑰香，子代中单萜醚的含量明显减少，但是cis-氧化玫瑰的含量依然是最高的，为24.55μg/L，其次依次是trans-氧化玫瑰、cis-呋喃型氧化里那醇和trans-呋喃型氧化里那醇。

  2.5 主要呈香单萜的香气值分析

  表2中列出了两个个葡萄亲本和后代在2014年和2015年内重要呈香单萜的香气值（OVAs），感官阈值和香气描述来源于文献。在亲本以及杂交子代F1中均检测到了20余种游离态单萜化合物，但是每种化合物对葡萄香气的贡献却各有不同。现已知的对葡萄和葡萄酒特征香气物质的研究报道中，一般根据香气物质的香气值，即OVA值（香气物质的含量与阈值的比值），来评价香气物质对香气特征的贡献。一般认为香气值大于1的化合物对整体香气有贡献，而且香气值越大，对其整体香气的贡献也越大；反之，如果香气值小于1，我们可以认为这种化合物对整体香气的贡献不大。

  从表中我们可以看出，玫瑰香的单萜物质的香气值最大，表明玫瑰香这一品种的香味较其他品种更加浓郁。其中cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰的香气值远远超过其他单萜物质的香气值，cis-氧化玫瑰的香气值最高，为204.57，trans-氧化玫瑰的香气值次之，为64.24，这说明cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰对玫瑰香特征香气的贡献较大，除此之外还有里那醇、香叶醇和橙花醛等物质也具有较高的香气值。红地球单萜化合物的香气值较低，只有橙花醛的香气值高于嗅觉阈值（OVA＞1）。

  在‘玫瑰香×红地球’组合中，香气值最高的也是cis-氧化玫瑰，其香气值为49.1，其次是trans-氧化玫瑰、橙花醛、香叶醇和里那醇；其中cis-呋喃-氧化里那醇、trans-呋喃-氧化里那醇和香叶醛的香气值为0，表明这两种化合物对组合香气基本没有贡献。

  根据化合物的香气特征，将这些呈香物质分为5个香气类型：花香、果香、植物味、香料味和香脂味，可以看出，亲本玫瑰香中主要以花香、果香和植物味为主，亲本红地球和克瑞森无核的香味较淡，主要是花香和果香；玫瑰香×红地球组合的香味主要以花香和果香为主。

  2.6 主成分分析

  玫瑰香×红地球后代单萜含量的主成分分析详见图1，单萜化合物彼此之间具有密切的相关性而且表现出PC1正值，而其余的非单萜化合物之间也有相关性但是却表现出PC2正值。由图可知，两年中游离态单萜物质的载荷系数图在两个种群中比较相似且稳定。在2014年，主成分1和主成分2占总方差的69.39%，其中香叶醛、橙花醛、别罗勒烯、γ-香叶醇和cis-异香叶醇对主成分1的贡献最大，α-松油醇、trans-氧化玫瑰、氧化橙花醇、cis-氧化玫瑰、α-水芹烯、里那醇和柠檬烯对主成分2贡献最大，由得分图可以看出，大部分子代和亲本的分布比较接近；在2015年，主成分1和主成分2占总方差的79.13%，其中γ-松油烯、β-cis-罗勒烯、里那醇、别罗勒烯、月桂烯、萜品油烯、α-松油醇和trans-呋喃型氧化里那醇对主成分1的贡献最大，β-香茅醇、橙花醛、香叶醇、橙花醇、香叶醇和cis-氧化玫瑰对主成分2贡献最大，大部分子代和父本红地球的分布比较接近，母本玫瑰香和子代相差较远。