病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤 张尊平 任 芳 胡国君 张梦研 李晨

  葡萄卷叶病是世界上广泛分布、危害严重的一种葡萄病毒病，能导致一些葡萄品种产量下降和品质降低。与该病相关的葡萄卷叶相关病毒（grapevine leafroll-associated virus，GLRaV）有6种，即GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4（包括GLRaV-5、GLRaV-6、GLRaV-9、GLRaV-Pr和GLRaV-Car等几个变种）、GLRaV-7和GLRaV-13。GLRaV-7最早于1996年从阿尔巴尼亚1株无症状的白色酿酒品种中发现，通过嫁接传染至‘赤霞珠’上，可诱导‘赤霞珠’植株产生轻微的卷叶病症状。之后被美国、希腊、匈牙利等10多个国家相继报道。明确病毒基因序列的变异，有利于其分子检测方法的建立及不同变种的致病性研究。目前关于GLRaV-7中国分离物的功能基因CP和HSP70的基因变异尚未见报道。因此，对来自中国15个省（市）自治区的188株葡萄样品进行了GLRaV-7检测，并对来源于42个GLRaV-7中国分离物的CP和HSP70的基因序列变异进行了分析，以期为进一步开展中国GLRaV-7不同分离物的分子检测和致病性研究提供依据。

  1  材料与方法

  1.1  材料

  2012—2015年从全国15个省（市）自治区随机采集葡萄休眠枝条188份，密封保湿后于4 ℃冰箱保存。

  1.2  引物

  根据GenBank已报道的GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因的保守序列，分别设计用于扩增GLRaV-7的CP和HSP70基因的PCR和巢氏PCR（nPCR）引物（表1）。其中，引物L7CP-L/R和L7HSP-L/R分别用于GLRaV-7分离物CP和HSP70基因序列的常规PCR扩增，引物L7CPn-L/R和L7HSPn-L/R用于第2轮的巣式PCR扩增。

  1.3  总RNA提取及RT-PCR

  总RNA提取采用柱式提取方法（范旭东 等，2014）。反转录在1.5 mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水7.0 µL、50 µmmol · L-1 6碱基随机引物（5′-NNNNNN-3′，上海生工合成）1.0 µL，总RNA 2.0 µL，离心混匀，95℃水浴5 min，冰上放置2 min；加入5× M-MLV buffer 5.0 µL、10 mmol · L-1 dNTPs 1.5 µL、200 U · mL-1 M-MLV逆转录酶0.8 µL、灭菌纯水2.7 µL，37 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，70 ℃ 5 min。合成的cDNA立即用于PCR扩增或放–20 ℃冰箱保存。

  常规PCR反应体系为25 μL，含10× Taq DNA聚合酶缓冲液 2.5 μL、10 mmol · L-1 dNTPs 0.5 μL、10 mmol · L-1引物各0.5 μL、5 U · mL-1Taq酶0.5 μL、模板cDNA 2.5 μL、灭菌纯水18 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环35次；72 ℃ 7 min；4 ℃终止反应。巢式PCR以第1轮PCR产物10倍稀释物为模板，反应体系及PCR程序基本相同，仅改变循环次数为30次。

  1.4  PCR产物克隆、测序

  PCR扩增获得的DNA片段采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）进行回收纯化。取4 μL纯化DNA与零背景TOPO TA克隆试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）中的10× Enhancer buffer 0.5 μL和pTOPO-T载体0.5 μL混匀，室温连接5 min后，转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，均匀涂布于含氨苄青霉素的LB培养皿上，放置于37 ℃的培养箱培养过夜。挑取单克隆菌落进行菌液培养，并通过PCR鉴定获得阳性的重组质粒，每个GLRaV-7分离物至少选3个阳性的重组质粒送北京诺赛基因组研究中心进行测序。

  1.5  序列分析

  采用在线工具ClustalW2 program（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）对获得的克隆序列进行同源性比对。如来源于同一样品中3个独立的单克隆序列同源性≥ 98%，则认为是一致的序列，仅用其中1个进行后续的序列分析。当3个独立的单克隆序列同源性＜ 98%，则选择差异的克隆序列进行后续分析。采用MEGA6.0软件（Tamura et al.，2013）的Neighbor-joining方法对本研究中获得的及GenBank已报道的HSP70和CP基因序列分别进行系统进化树分析。采用重组分析软件RDP3.0对GLRaV-7分离物HSP70和CP基因序列中可能存在的重组事件进行分析。

  2  结果与分析

  2.1  RT-PCR检测

  采用引物L7CP-L/R和L7HSP-L/R对188个葡萄样品进行了常规RT-PCR检测，引物L7CP-L/R检出率为5.3%（10/188），引物L7HSP-L/R未检测到阳性样品。采用引物L7CPn-L/R和L7HSPn-L/R对其进行第2轮巢式PCR检测，检出率分别为24.5%（44/188）和8.5%（16/188）。采用引物L7HSPn-L/R检测为阳性的样品，引物L7CPn-L/R也可检测为阳性。采用这些引物对188个葡萄样品总的检出率为24.5%。

  6个省（市）自治区的样品检测出GLRaV-7，包括河北（50%，4/8）、新疆（46.2%，6/13）、天津（33.3%，2/6）、辽宁（28.7%，25/87）、山东（21.1%，8/38）和北京（6.3%，1/16）；宁夏、上海、广西、甘肃、云南、安徽、广西、四川和福建等地的葡萄样品中未检到GLRaV-7。美洲种葡萄GLRaV-7检出率最高，为36.7%，其次为欧美种葡萄（26.3%）、欧亚种葡萄（25.8%）和山欧葡萄（7.1%）。砧木的检出率较高，为36.4%，鲜食葡萄和酿酒葡萄检测率分别为30.7%和18.4%。

  2.2  MP和CP基因序列分析

  对PCR产物进行回收、克隆及测序，除去克隆内部同源性 ≥ 98%的序列，共获得来源于42个GLRaV-7分离物的CP基因序列为45条，及来源于15个GLRaV-7分离物的HSP70基因序列16条。其中，LN-SDHN2和LN-ZF分离物的CP基因克隆之间及LN-ZSX分离物内的HSP70基因克隆之间存在同源性＜98%的序列。这些序列已提交至GenBank数据库，登录信息见表2。将获得的序列与已报道的序列进行同源性比较，CP基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.1% ~ 100.0%和88.9% ~ 100.0%，HSP70基因序列的分别为85.3% ~ 100.0%和88.9% ~ 100.0%。

  首先利用Datamonkey软件（http：//www.datamonkey.org/）中的SBP（single breakpoint scanning）和GARD（genetic algorithm recombination）方法对所有GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因核苷酸序列进行内部重组事件分析，结果表明CP基因序列中存在重组事件，HSP70基因序列无重组事件发生（结果未列出）。同时，也采用重组分析软件RDP V.4.22对CP基因序列的重组事件进行分析，结果表明LN-ZF clone 9为一个重组序列（6种重组分析方法支持），它的两个亲本分别为Gp2中的LN-QWH1和Gp3中的LN-228。

  2.3  进化树分析

  将本研究中获得的CP和HSP70基因序列与GenBank已登录分离物的CP和HSP70基因序列一起进行系统进化树分析，结果（图1）显示构建的CP基因系统进化树将GLRaV-7分离物划分为6个组群，HSP70基因进化树将GLRaV-7分离物划分为5个组群。重组子LN-ZF clone 9在CP进化树中形成了一个独立的进化分支（图1）。由于LN-ZF clone 9、日本分离物Ru、阿富汗分离物GLRaV-7-Afg和智利分离物CI-3473在进化树中均未与其他分离物聚在一起，因此，暂未对其进行分组。CP和HSP70进化树分析结果显示，中国分离物分别被划分到5个组群中，组群Gp1和Gp2的中国分离物居多，Gp3、Gp4和Gp5仅包含中国分离物，属于新的组群。

  3  讨论

  前，果树病毒病主要以预防为主，及时清除田间带毒植株及栽植无病毒苗木是目前主要的防控措施。病毒检测在病毒病防控中占据重要地位。本研究中对来自中国不同地区不同品种的188份葡萄样品进行了GLRaV-7检测，其中常规RT-PCR检测结果不理想。一方面可能是GLRaV-7在葡萄植株体内浓度偏低，导致常规的RT-PCR方法很难检测出；另一方面也可能由于采用的引物是基于有限的GLRaV-7分离物序列设计的，本身的扩增能力较差，从而导致扩增失败。采用巢式PCR方法改善了GLRaV-7的检测，扩增获得了来源于42个GLRaV-7分离物的CP基因和15个GLRaV-7分离物的HSP70基因序列，明确了GLRaV-7分离物CP和HSP70基因变异特点，为分子检测工具的研发打下了基础。

  先前研究已对GLRaV-7的p61蛋白基因进行了系统进化树分析，其结果表明中国的GLRaV-7分离物属于3个组群中的2个。目前GenBank上已登录的国外GLRaV-7的CP基因和HSP70基因序列数量明显多于P61蛋白基因序列，且长线性病毒科的病毒分类及遗传多样性通常依据CP基因和HSP70基因序列变异情况来划分的，因此，基于CP和HSP70基因的遗传多样性的分析更能全面了解GLRaV-7的整体变异情况。本研究中基于CP和HSP70基因的系统进化树分析结果表明，中国的分离物属于5个明显区分的组群，其中，Gp3、Gp4和GP5仅包含中国分离物，是3个新的组群。研究的结果也显示一些GLRaV-7分离物，比如CP基因系统进化树中的日本分离物Ru和中国分离物LN-SDHN2，以及HSP70基因系统进化树中的LN-BWSK，分别形成单一的进化分支，这表明中国的GLRaV-7分离物具有更为复杂的基因变异和遗传多样性。另外，通过重组分析软件发现，其中1个变种序列（LN-ZF clone9）为CP基因内部重组序列。本研究的结果丰富了GLRaV-7的基因多样性，为进一步揭示GLRaV-7分离物的遗传进化特点及不同变种的致病性研究提供了依据。本研究中首次对GLRaV-7国内外分离物的CP和HSP70基因变异及系统进化进行了分析，明确中国部分葡萄样品中GLRaV-7的分子变异特点，发现3个新的组群，这为下一步GLRaV-7不同分离物分子检测和致病性差异的研究提供依据。