无核材料创制岗位

  无核性状是国际鲜食葡萄的重要研究和育种方向。胚挽救技术的应用，使种子败育型葡萄作母本进行大田杂交后，不仅提高后代的无核率，而且缩短育种周期。种子败育型葡萄果实发育进程中，种子败育与形成无核果实的相关基因是什么？这些基因表达与调控机理是什么？搞清楚这些基因的作用与相互关系，对无核葡萄育种具有重要的科学意义与实际应用价值。本文首先以种子败育型葡萄‘无核白’为材料，在种子败育过程中观察胚珠的形态和组织解剖结构，并测定其内源激素含量，分析不同基因在‘无核白’和有核葡萄‘黑比诺’的种子败育/发育过程中的差异表达，筛选出种子败育相关基因；同时以种子败育型葡萄作母本，引入抗病的中国野生葡萄及其后代材料作父本杂交后，利用胚挽救技术创制无核抗病新种质。取得的主要结果如下：

  1.‘无核白’种子败育过程中形态、组织解剖和内源激素水平等发生变化。在32~42 DAF（day after flowering，开花后天数）观察杨凌地区‘无核白’发育的胚珠形态大小不一，在37 DAF其种皮褐变和皱缩。石蜡切片观察‘无核白’从32 DAF开始胚囊皱缩，胚乳细胞降解、退化，且内、外种皮分离，在42 DAF与‘红宝石无核’的球形胚相比，‘无核白’的胚体积小，胚发育延缓。测定‘无核白’胚珠中GA3和ZR含量从36 DAF开始下降，IAA含量从37 DAF开始下降，ABA含量从34 DAF持续升高，（GA3+IAA）/ABA和ZR/ABA含量比率分别从34 DAF和36 DAF开始下降。分析激素合成信号基因的表达情况，从30~45 DAF赤霉素合成基因VviGA2ox-3和VviGA3ox-1的表达量下降，生长素抑制子VviAUX/IAA4和VviAUX/IAA8以及脱落酸信号基因VviSnRK2.1和VviSnRK2.2的表达量上升。

  2.在‘无核白’和‘黑比诺’8个不同败育/发育的胚珠中种子发育相关基因、不同转录因子及水杨酸合成和信号途径基因差异表达。从20~55 DAF，8个不同发育时期的胚珠中，种皮发育相关基因VviAGL11和胚乳发育相关基因VviFIS2和VviIKU2的相对表达量均在‘无核白’中持续降低，在‘黑比诺’中升高；胚乳发育基因VviPHERES1在‘无核白’中先升高后降低，在‘黑比诺’中持续升高；转录因子VviWRKY3、VviWRKY52和VviHB7在‘无核白’中的表达量持续升高，但在‘黑比诺’中变化趋势不明显，VviWRKY6的表达量在‘无核白’中先升高后降低，在‘黑比诺’中基本不变。依赖水杨酸合成和信号途径基因VviEDS1.2、VviNDR1和VviSID2的表达量在‘无核白’中升高，引起免疫防御反应，促进种子败育。不同组织表达特性分析，VviAGL11、VviIKU2、VviWRKY3、VviWRKY6和VviWRKY52在无核葡萄和有核葡萄的胚珠中表达量最高；VviPHERES1在有核葡萄的胚珠中表达量最高。

  3.利用胚挽救技术以种子败育型葡萄为母本分别与中国野生葡萄（杂种）、欧洲无核葡萄作父本杂交，共配置了24个组合，获得2259株无核、抗病新株系。以‘红宝石无核’‘昆香无核’和‘火焰无核’作母本，‘塘尾’‘双优’‘北醇’‘阳光玫瑰’‘红宝石无核’‘无核白’和‘爱神玫瑰’等作父本时胚挽救效率较好。当‘无核白’‘红宝石无核’‘火焰无核’‘昆香无核’和‘克瑞森无核’分别作母本时，最佳取样时间分别为开花后39天、授粉后57~58天、40~41天、50天和42天。研究生长调节剂对胚挽救效率的影响，在‘火焰无核’葡萄开花前外源喷施5 mg/L的油菜素内酯，显著提高其胚发育率，并增加多胚的数量；以ER为基础培养基，添加水杨酸合成抑制剂可提高胚发育率；以WPM为基础培养基，添加1.0 μmol TDZ显著提高杂种胚的成苗率。

  4.通过分子标记辅助选择和田间抗病性调查获得一批无核、抗病新种质。共移栽炼苗成活1662个胚挽救杂种，通过无核性状分子标记GSLP1和SCF27检测杂种后代中携带目的条带有484株；通过抗霜霉病分子标记S382和S294检测杂种后代中携带目的条带有25株。田间抗病性鉴定出杂种后代中抗白粉病51株和抗霜霉病96株。

  综上所述，‘无核白’种皮发育相关基因VviAGL11的转录水平降低，促进种皮褐变、皱缩，内外种皮分离；胚乳发育相关基因VviFIS2、VviPHERES1和VviIKU2的转录水平降低，促进胚乳降解；以及内源GA3、IAA、ZR和ABA之间的含量变化和水杨酸合成和信号基因介导的防御反应等，共同促进葡萄种子败育，且种皮的降解与胚乳的退化同步发生。