鲜食葡萄品种改良岗位

  1 材料与方法

  1.1 材料

  本研究田间采样地点位于北京市平谷区马昌营镇前芮营村（北纬40°13′，东经117°12′），采样时间为2019年。葡萄园采用简易避雨、地表覆盖园艺地布和滴灌供水管理模式，机械埋土越冬。香气检测实验在北京市林业果树科学研究院进行。

  1.2 试验方法

  同一处理4株为一小区，随机区组实验，每小区选取长势基本一致的3株树，3个小区重复。2019年8月底，每个处理于树体东、西两侧各部位随机采取6-8穗果实带回实验室进行果实重量、可溶性固形物以及可滴定酸的测定。采用数显糖度计（Atago，PAL-1）测定可溶性固形物（TSS），读取5个数据；0.1 mol.L-1 NaOH滴定法测定可滴定酸，3次重复。

  1.3 香气化合物提取

  游离态：将放置于-80℃超低温冰箱中的葡萄果实取出，称量50 g用于香气提取分析。用液氮迅速冷冻，剪掉果梗、去籽；之后加入0.5 g D-葡萄糖酸内酯，抑制糖苷酶活性，加入2 g交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)防止样品氧化，将葡萄果实打碎成粉末，均匀混合后转移到50 mL离心管中，在室温条件下静置2 h；随后进行离心，转速为8000 r min-1，时间为10 min，离心后将上清液转入50 ml离心管中，取5 ml果汁用于进样及GC-MS分析，每个样品做两个技术重复。剩余果汁于-80超低温℃冰箱中冻存。

  结合态：称取1.63 g柠檬酸、0.79 g柠檬酸钠以及16 g氯化钠，加入50 mL蒸馏水，配置成柠檬酸缓冲溶液（pH=5，2 M）；加入10 mL甲醇，而后加入10 mL蒸馏水，活化固相萃取柱；加入澄清葡萄汁2 mL；之后加入2 mL蒸馏水进行洗脱，将葡萄汁样品中含有的极性低分子量物质洗去除掉；加入二氯甲烷5 mL，去除葡萄果汁样品中的游离态香气化合物；加入甲醇20 mL，并用圆底烧瓶收集（50 mL）洗脱出来的液体。将洗脱液体旋转蒸干，条件为：真空下30°C；加入柠檬酸缓冲液（2M, pH=5）5 mL，对糖苷结合态香气组分进行溶解，需混合均匀；取4.9 mL混合液装入20 mL的样品瓶中，并将样品瓶用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子拧紧；加入提前配置好的浓度为100 g. L-1的糖苷酶（AR 2000）100 uL，放置于40℃恒温培养箱中酶解16 h；以上操作，每个样品需做两个独立重复。

  1.4 单萜化合物检测

  气相色谱与质谱联用仪（GC-MS）型号：Agilent 7890B GC和Agilent 5977A MS (Agilent，美国)。毛细管柱为HP-INNOwax 60m×0.25mm×0.25μm （J&W Scientific，美国）。

  GC-MS条件参考Wu等发表的方法：载气为高纯氦气（He，>99.999%）,流速为1 mL/min；进样口温度为250 ℃，采样不分流模式，解析时间8 min；升温程序为50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min 升温到220 ℃，保持5 min。质谱电离方式为EI，离子源温度为230 ℃，电离能为70 ev，四级杆温度为150 ℃，质谱接口温度为280 ℃，质量扫描范围为30-350 u。

  1.5 单萜化合物定性定量分析

  数据处理和分析是通过ChemStation软件（安捷伦科技公司）进行。利用NIST 05标准库中参考标准品的保留指数和质谱匹配来鉴别挥发性化合物。当标准品不可用时，处理保留指数与文献中报告的保留指数的比较。为了量化，使用标准物与内标物的峰面积比与参考标准物浓度对有参考标准物的挥发物进行量化，而使用具有相似碳原子或结构的标准物对没有可用标准物的挥发物进行量化。

  1.6 数据处理与统计分析

  统计分析使用软件SPSS20.0，香气轮廓雷达图的绘制使用Excel 2019作图。主成分分析采用XLSTAT 2019进行绘制，聚类热图通过 MetaboAnalyst 4.0进行分析绘制，正交偏最小二乘判别分析使用SIMCA-p 14.0软件。

  2 结果

  2.1 砧木对‘瑞都香玉’和‘瑞都红玉’品种理化指标的影响

  两个品种的果实品质指标如表1所示。‘瑞都香玉’组合中，XY/SO4单穗重最大，显著高于XY/3309M、XY/5BB和XY；‘瑞都红玉’组合中，HY/110R单穗重最大，显著高于HY/3309M、HY/SO4和HY。‘瑞都香玉’各组合单粒重在5.3g-6.4 g之间；‘瑞都红玉’各组合差异很小，单粒重在5.0 -5.5 g之间。XY/5BB的可溶性固形物含量显著高于自根苗，其它组合与自根苗相比无显著性差异，而且各种砧穗组合中可滴定酸含量无显著差异。‘瑞都红玉’各组合和自根苗之间的可溶性固形物含量无显著差异，而各砧穗组合的可滴定酸含量显著高于自根苗。‘瑞都红玉’组合中自根苗固酸比最高，‘瑞都香玉’组合中固酸比最高为XY/5BB。综合而言，5种砧木品种均提高了‘瑞都红玉’的可滴定酸含量，砧木5BB提高了‘瑞都香玉’果实的可溶性固形物含量。

  2.2 不同砧穗组合中游离态和结合态化合物的特征

  用于定量的标准化合物和标准曲线见附表1，在‘瑞都香玉’和‘瑞都红玉’两个品种的成熟期果实中，共检测到56种游离态化合物，如表2和表3所示。根据其化学结构可分为10种C6/C9化合物、8种醇类化合物、3种脂肪酸类化合物、6种醛酮类化合物、4种C13降异戊二烯类化合物和25种萜烯类化合物。

  对于游离态化合物的种类来说，两个品种嫁接在5BB上，都能检测到56种化合物，其它4种砧木都会影响嫁接后果实中化合物种类，如在XY/3309M中未检测到2甲基-3-丁烯-2-醇、庚醛和3-甲基丁醛，在XY/1103P、XY/110R、XY/SO4中均未检测到2甲基-3-丁烯-2-醇和庚醛两种物质。

  对‘瑞都香玉’而言，5BB对各类游离态化合物的浓度表现出显著的抑制作用，其余4种砧木均能促进游离态化合物总量的积累。其中1103P、110R和SO4对萜烯类化合物的积累具有显著的促进作用，比如里那醇、月桂烯、cis-氧化玫瑰、氧化里那醇的含量都是自根苗的2倍以上，D-柠檬烯、β-顺式罗勒烯、橙花醇、香叶醇、香茅醇、β-水芹烯的含量都是自根苗的3倍以上，而α-松油醇和脱氢里那醇含量则达到自根苗的6倍以上。

  2.2 香气化合物主成分分析

  为了研究不同砧木对香味物质的影响，解析不同砧穗组合下的特征香气成分，对游离态化合物和结合态化合物分别开展主成分分析（PCA）。从游离态化合物的PCA分析结果（图1a）可以看出，第一主成分贡献率为86.04%，第二主成分贡献率为4.97%，PC1可以很好将‘瑞都香玉’中的4种砧穗组合与‘瑞都香玉’自根苗和‘瑞都红玉’所有组合区分开，从化合物分布的情况来看，大部分化合物集中分布在第一、四象限，萜烯类化合物集中分布于第四象限，与XY/1103P、XY/110R 、XY/SO4分布重叠在一起。

  从糖苷结合态化合物的PCA分析结果看（图1b），第一主成分贡献率为48.71%，第二主成分贡献率为22.51%，第一主成分可以很好的将两个品种的砧穗组合分开，‘瑞都红玉’自根苗和各砧穗组合全部集中分布在坐标左侧，‘瑞都香玉’自根苗和各砧穗组合全部集中分布在坐标右侧，从化合物分布的情况来看，结合态萜烯化合物主要分布在第一、二象限，其它结合态化合物主要分布在第三、四象限，其中‘瑞都香玉’各砧穗组合与萜烯化合物分布重叠。

  2.3 不同砧穗组合中特征化合物的回归分析

  针对两个品种各种砧穗组合中的游离态化合物开展正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）。对‘瑞都香玉’而言，XY/3309M中筛选不到特征化合物，其它4种砧木均能筛选出特征化合物，从回归模型得分图上可以看出4种砧木非常明显的将其它砧穗组合区分开。拟合度检验之后的R2X 、R2Y 、Q2Y值都在0.764-0.992之间，表明了该回归模型较好的预测能力（表4）。嫁接苗和自根苗之间的特征化合物变量分析表明，在各个砧穗组合之中一共有18种VIP得分大于1的特征化合物，其中有5个特征化合物从XY/1103P中筛选出来，分别是2-己烯醛、里那醇、己醛、萜品油烯和β-月桂烯；有9个特征化合物从XY/110R中筛选出来，比XY/1103P多了（E）-2-己烯醇、1-己醇、香叶酸和醋酸；有6个特征化合物从XY/5BB中筛选出来，有14个特征化合物从XY/SO4中筛选出来。2-己烯醛、里那醇、己醛是4种砧穗组合的共有特征化合物。

  对‘瑞都红玉’而言，所有5种砧木都能筛选出特征化合物。拟合度检验之后的R2X 、R2Y 、Q2Y值都在0.498-0.946之间。其中1-己醇、香叶酸和里那醇是所有砧穗组合中共有的特征化合物 。

  2.4 不同砧穗组合的香气轮廓分析

  香气值（OAV，odor activity value）是评价葡萄及葡萄酒中挥发性成分对香气贡献的一个常规指标，通常由挥发性成分的浓度除以其感官阈值得到，当化合物OAV>1时认为该化合物对整体的香气起到贡献作用；且OAV值越大，贡献也越大。化合物的感官阈值与香气描述均参考已发表的文献，化合物溶解介质为水溶液，计算所有样品的每个化合物的OAV值，筛选OAV值大于1的化合物，并将化合物按其气味特征进行分类，对样品的香气轮廓进行模拟。将葡萄香气类型分为10类：1=玫瑰香、2=青草香、3=柠檬香、4=柑橘香、5=薄荷味、6=蘑菇味、7=脂肪味、8=甜味、9=其它花香、10=其它果香。

  在‘瑞都香玉’品种的游离态香气化合物中，共有24种化合物其浓度大于阈值，己醛、3-己醛、β-大马酮、cis-氧化玫瑰、trans-氧化玫瑰、里那醇、β-月桂烯等具有非常高的香气值，赋予葡萄青草香、玫瑰香、柑橘香等其它花香和果香等香气特征。在‘瑞都红玉’品种的游离态香气物质中，共有14种化合物其浓度大于阈值，E-2-壬烯醛、cis-氧化玫瑰、trans-氧化玫瑰、里那醇等具有较高的香气值。

  从图2（a）中可看到，与‘瑞都香玉’嫁接苗和自根苗香气轮廓基本一致，主要由青草香、柑橘香、其它花香和其它果香构成，除XY/5BB外，其它4种砧木的青草香、柑橘香、其它花香和其它果香味均显著高于自根苗，其中XY/1103P中己醛的香气值高达2205.31，里那醇的香气值高达1979.61。‘瑞都红玉’品种的嫁接苗和自根苗的香气轮廓基本一致，主要由柑橘香、其它花香和其它果香构成，5种砧木的柑橘香、花香与果香均显著高于自根苗，且HY/5BB的香味最高。

  在‘瑞都香玉’和‘瑞都红玉’的结合态香气物质中，共有6种化合物其浓度大于阈值，cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰具有较高的香气值，可赋予葡萄玫瑰香的香气特征。从图2（b）可看到，两个品种不同砧穗组合香味类型基本一致，XY/3309M、XY/5BB、XY/SO4的玫瑰香味显著高于自根苗，其它香味均无显著性差异，HY/5BB的玫瑰香味显著高于自根苗。