病毒病防控岗位

李 晨 范旭东 张尊平 胡国君 任芳 张宝东 董雅凤

  香气是葡萄的重要感官和品质指标，是评价优良葡萄种质资源的关键因素之一。近年来，随着消费者对多元化品种的需求，一些香味葡萄品种也因其独特的感官品质备受人们追捧，‘巨峰’、‘玫瑰香’、‘夏黑’、‘阳光玫瑰’等葡萄品种大面积发展，尤其是近2年‘阳光玫瑰’成为热门品种。2018—2019年，采用RT-PCR方法对来自13个省（市、自治区）的6个香味葡萄品种的212个样品进行了14种葡萄病毒的检测，初步明确了我国6个香味葡萄品种的带毒状况。

  1  材料与方法

  1.1  试验材料

  2018—2019年采集来自我国13个省（市、自治区）的6个香味葡萄品种的样品212个，其中包括59个‘阳光玫瑰’样品（来源于安徽、福建、广西、河南、江苏、辽宁、山东、上海、云南）、31个‘玫瑰香’样品（来源于北京、河北、辽宁、天津、浙江）、47个‘巨峰’样品（来源于安徽、广西、河北、江苏、辽宁、山东、上海、四川、浙江）、30个‘夏黑’样品（来源于山东、上海、江苏、云南、广西、安徽）、22个‘水晶葡萄’样品（来源于贵州）、23个‘着色香’样品（来源于辽宁和吉林）。

  1.2  试验方法

  1.2.1  RNA提取及cDNA合成

  采用柱式提取方法进行总RNA的提取。反转录在1.5 mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水20.0 μL、50 μmol/L六碱基随机引物（上海生工生物工程技术服务公司合成）2.0 μL，总RNA 8.0 μL，离心混匀，72 ℃保温10 min，冰上放置2 min；加入5×M-MLV buffer 10.0 μL、10 mmol/L dNTPs 2.5 μL、200 U/mL M-MLV逆转录酶1 μL、灭菌纯水6.5 μL，离心混匀，37 ℃10 min，42 ℃ 50 min，70 ℃ 5 min。合成的cDNA立即用于PCR扩增或置于-20 ℃冰箱中保存。

  1.2.2  PCR扩增

  根据已报道的14种葡萄病毒序列合成特异性引物，以cDNA为模板分别进行PCR扩增，扩增体系为：cDNA2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，DEPC H2O补足总体积至25 μL。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增均设阴性和阳性对照，其中，GFLV检测需采用巢氏PCR方法，进行第二轮扩增。

  2  结果与分析

  2.1  RT-PCR检测结果

  59个‘阳光玫瑰’葡萄样品中带毒样品55个，带毒株率93.22%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE、GFabV、GLRaV-1、GLRaV-4和GFLV共13种病毒，检出率3.39%～66.10%；31个‘玫瑰香’样品中带毒样品21个，带毒株率67.74%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE和GFLV共10种病毒，检出率3.23%～38.71%；47个‘巨峰’样品中带毒样品39个，带毒株率82.98%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE和GLRaV-4共10种病毒，检出率2.13%～70.21%；30个‘夏黑’样品中带毒样品19个，带毒株率63.33%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GVA、GLRaV-2、GVE、GFabV和GFLV共8种病毒，检出率3.33%～40.00%；22个‘水晶葡萄’样品中带毒样品6个，带毒株率27.27%，检测到GVA、GLRaV-2和GVE共3种病毒，检出率4.55%～22.73%；23个‘着色香’样品中带毒样品10个，带毒株率43.48%，检测到GRSPaV、GFkV和GLRaV-2共3种病毒，检出率17.39%～26.09%（表1、图1）。所有样品均未检测到GLRaV-7。

  2.2  病毒在不同地区及复合侵染的发生情况

  病毒复合侵染在6个香味葡萄品种中普遍发生（表2）。‘阳光玫瑰’以2～5种病毒复合侵染为主，其中2种病毒复合侵染率为25.42%，3种病毒复合侵染率为10.17%。‘玫瑰香’以3种病毒复合侵染为主，复合侵染率为29.03%。‘巨峰’和‘夏黑’以2～4种病毒复合侵染为主，复合侵染率分别为10.64%～21.28%和6.67%～10.00%。‘水晶葡萄’和‘着色香’主要为2～3种病毒复合侵染，复合侵染率分别为9.09%和8.70%。

  3  讨论与结论

  本研究发现，葡萄病毒在6个香味品种中发生普遍，其中分布较广的有GRSPaV、GFkV、GLRaV-3以及近几年新报道的GPGV和GINV；检测结果显示，玫瑰香型的‘阳光玫瑰’和草莓香型的‘巨峰’、‘夏黑’以GRSPaV、GFkV、GLRaV-3侵染居多，近几年报道的GPGV、GINV、GFabV在我国主栽香味葡萄品种中侵染率也较高，例如，玫瑰香型的‘玫瑰香’葡萄以GPGV（38.71%）侵染为主。因此，香味品种中新病毒的发生和危害需引起高度重视，同时，有必要加强新病毒的传播途径研究，从而为其防控提供依据。

  近年来，香味葡萄品种栽培面积迅速扩大，苗木生产量大、流通频繁，极大地增加了葡萄病毒感染几率。‘阳光玫瑰’、‘玫瑰香’、‘巨峰’和‘夏黑’栽植范围广，来自各地的样品大部分检测到葡萄病毒，而‘水晶葡萄’和‘着色香’主要分布于贵州及辽宁，样品带毒率相对较低。葡萄病毒复合侵染是一种常见现象，通常复合侵染严重的植株病症表现明显，果实品质下降，严重时可致树体死亡，给葡萄产业带来极大威胁。对6个香味品种的病毒检测结果统计后发现，在‘阳光玫瑰’、‘巨峰’和‘玫瑰香’上2种及以上葡萄病毒复合侵染现象更普遍，复合侵染率达86.44%、51.06%、48.39%，复合侵染的组合方式有多种，其中‘阳光玫瑰’单个样品中最多检测出9种病毒，以GRSPaV、GFkV和GLRaV-3与其他葡萄病毒组合的复合侵染比例最高，而‘玫瑰香’则以GPGV和GINV与其他葡萄病毒组合居多。‘水晶葡萄’与‘着色香’葡萄病毒复合侵染现象不突出，可能与其地域性栽培和扦插繁殖使病毒传播和累积受限有关。分析结果还发现，GRSPaV+GFkV+GLRaV-3以及GPGV+GINV的复合侵染率较高，是否与这几种病毒的传播途径有关，有待进一步研究。

  本研究初步明确了‘阳光玫瑰’、‘巨峰’、‘夏黑’、‘玫瑰香’、‘着色香’、‘水晶葡萄’等6个香味葡萄品种的病毒种类及侵染状况，为其引种栽培、病毒早期检测及病毒病防控提供了依据。