左家综合试验站

许培磊

  山葡萄是北方地区可露地越冬的酿酒葡萄，既是重要的抗寒抗病育种资源，又是东北葡萄酒工业的重要原料，山葡萄品种多是‘双庆’的后代，其果穗中多带有小青粒特征，表现为在一串葡萄中，一些相对较小的浆果在收获前不能成熟并保持绿色的果皮，这些浆果是无核的或可能只含有种子的痕迹，被称为“弹砂果”，在山葡萄中被称为“小青粒”。这种因为不同大小浆果在同一串葡萄中产生的“异质性”会导致葡萄优质果率、产量下降，并可能影响葡萄酒质量。不同葡萄品种的异质性程度差异很大。在山葡萄个别品种中，一穗葡萄中大约含有20%-30%的小青粒。对于山葡萄中小青粒滞育的表现过程及机理研究甚少。本研究以山葡萄不同花性的资源82份与两个花性品种为试验材料，对其青粒率进行调查，并对两性花品种‘双丰’果粒发育动态进行观察，旨在为山葡萄青粒形成机理的解析奠定基础，并为山葡萄品种选育提供参考。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  试验材料为山葡萄82份种质资源（雌能花种质资源31份，两性花种质资源51份）、品种‘双丰’、‘左山一’。资源试验于国家园艺种质左家山葡萄分库内进行，资源库位于北纬44°04′，东经126°05′，年降水量679 mm。2017年最高气温34℃，最低气温-28℃。位于南向缓坡地，土壤为暗棕森林土。每份资源经扦插繁殖，每空6株，采用单臂篱架架式，株行距1.0 m×2.5 m，全园采用常规的肥水管理模式。

  1.2 试验方法

  1.2.1 82份山葡萄种质资源的青粒率统计  在山葡萄果实成熟期，采集82份山葡萄资源的果穗，每个资源采集3穗，带回实验室，将果粒分为大粒和青粒两组，分别计算各组果粒数和所占百分比。

  1.2.2 ‘双丰’与‘左山一’青粒率占比统计  资源库中保存有168株‘双丰’和165株‘左山一’成龄树，在山葡萄果实成熟期，选取长势一致的植株，随机采集两品种果穗各8个，带回实验室，每穗按照果实颜色和果柄粗细进行摘粒并区分，计算大粒（紫粒）、青粒、总果粒数及青粒率。

  1.2.3 ‘双丰’授粉亲和性观察  选取长势一致的山葡萄品种‘双丰’4株，2017年始花期之前每株树选取3穗花序发育良好的花序。人工去雄后6穗授‘双丰’花粉，6穗授雄株混合花粉，套袋，于授粉后1、3、7、14h间隔取样，每个时间点采集20朵花放入FAA固定液中，24h后转入70%的酒精中，于4℃冰箱保存。参考秦红艳等（2017）苯胺蓝染色法，用尼康80i正置荧光显微镜对花粉在柱头上萌发及花粉管伸长情况进行观察拍照。

  1.2.4 ‘双丰’果粒发育动态观察  参照COOMBE（1995）的方法，将葡萄生长阶段区分为E-L 1-E-L 47，共47个发育阶段，山葡萄花期结束后，自E-L 27开始进入坐果期至E-L 34转色期前，整个这个阶段是浆果膨大期，也是山葡萄青粒形成的时期。我们以两性花品种‘双丰’为试材，每个品种选择在阳面的中上部的6个果穗，在花期结束后（此时花帽全部脱落），用红色马克笔标记小粒（果柄未加粗）和中粒（果柄稍有加粗），自盛花期后17d-29d，每天观察中小粒在果穗中的位置及大小变化。在盛花期后42d，56d和98d观察果穗中大小粒变化并拍照。

  1.3 数据统计与处理

  青粒率=[青粒数量/（青粒数量+大粒数量）]*100 %

  利用Excel软件进行数据统计，SAS 9.4进行数据分析。

  2 结果与分析

  2.1 82份山葡萄种质资源的青粒率

  山葡萄种质资源间青粒率差异较大，31份雌能花资源青粒率在1.01 %~54.02 %之间，平均值为17.75 %；51份两性花资源青粒率在2.83 %~77.25 %，平均值为24.15 %。经过t检验，发现雌能花资源青粒率显著低于两性花资源（p < 0.05）。比较两类资源的果粒数时发现两性花的平均果粒数为77.92个，雌能花的平均单果粒数为45.88个，两性花果粒数显著高于雌能花果粒数（p < 0.05）。雌能花青粒率较低的资源是通化三号和086931，两性花中青粒率较低的资源是RS和74-1-326。

  2.2 ‘双丰’与‘左山一’青粒率比较

  两性花品种‘双丰’的青粒率平均为31.62 %，雌能花品种‘左山一’的青粒率平均为24.36 %。成熟时，‘双丰’的成熟紫粒为129.63个，青粒数为58.75个；‘左山一’的成熟果粒为64.75个，青粒数为23.75个。可以看出‘双丰’的果粒数是‘左山一’的2.13倍（p < 0.05），青粒数是‘左山一’的2.47倍（p < 0.05），‘双丰’的青粒率是‘左山一’的1.28倍，但差异不显著。

  2.3 ‘双丰’授粉亲和性观察

  运用苯胺蓝染色法对自花授粉和异花授粉的‘双丰’进行荧光显微镜观察，结果如图3所示，授粉1h时，‘双丰’花粉在‘双丰’柱头上没有萌发，雄株花粉在‘双丰’柱头上有少量萌发；3h时，‘双丰’花粉开始萌发，此时雄株花粉已经伸长；7h和14h时，异花授粉的花粉萌发量和花粉管伸长长度均比自花授粉效果好。对于‘双丰’来说，异花授粉的花粉亲和性好于自花授粉，花粉萌发及花粉管伸长时间快于自花授粉。

  2.4 ‘双丰’果粒发育动态观察

  为了研究果实膨大期不同果粒类型的区分标准，通过对‘双丰’中粒和小粒标记及动态观察（图4），发现盛花期后17 d时肉眼已经能够区别果柄是否发育，所标记的中粒和小粒在果实快速膨大期内发育缓慢，果穗中标记中粒和小粒，不会随着大果粒膨大而发生膨大，始终保持较细的果柄粗度和较小的粒径。小粒和中粒分布在果穗的上（近端）、中、下（远端）部位，位于远端部位的小果粒易聚集存在。

  如图5所示，黑色箭头标记的为果柄没有膨大的小粒，在42DAF和56DAF时存在，在98DAF果实成熟时会发生脱落，此类滞育浆果由于体积较小，对于葡萄异质性和酒质的影响较小，在本研究中被定义为‘小粒’。另一类滞育浆果如图中红圈中标出的果粒，果柄和果粒均比花后膨大一些，但比正常果粒小得多，这类已经有膨大的果粒在后期不发生脱落，形成青粒，因此浆果膨大期的中粒能够发育成为成熟期的青粒。

  3 讨论

  3.1 花性对果粒大小的影响

  果实发育与授粉受精情况存在关系。果实发育初期，若雌蕊授粉受精不良，会导致果穗中未经受精的子房发生脱落，在脱落的子房中有些是已经授粉，但并未完成受精。即使是完成受精的子房仍会有一部分不能正常发育，在山葡萄中便发育成了青粒，因此青粒的形成与花性和授粉受精情况存在关系。

  雌能花山葡萄均是由异花授粉，两性花山葡萄可以通过自花和异花授粉两个途径完成授粉受精，但其实大多数栽培葡萄品种所授的花粉均来自于自身的花药，风仅负责偶尔的异花授粉。韩先焱发现‘双丰’在花前存在闭花受精现象，说明‘双丰’以自花授粉为主。本研究对不同来源的花粉在‘双丰’柱头上进行的授粉亲和性试验发现异花授粉的花粉萌发和花粉管伸长速度较快，由于开花后，胚珠仅能在有限的时间内接受花粉管送来的精细胞，因此花粉管伸长速度对于结实非常重要，有研究表明异花授粉的花粉管伸长速度较快，并比自花授粉的结实率高，浆果大小受到异花授粉的影响，说明异花授粉能够改善种子的形成，从而影响青粒率的多少。

  山葡萄的两种花性及两个品种，都存在小青粒，青粒率在资源间差异较大，雌能花资源的青粒率小于两性花，‘左山一’的青粒数显著少于‘双丰’，青粒率较低。果粒数的差异是花性之间的主要差异，无论是种质资源还是品种，都可以看出雌能花的果粒数只占两性花的一半，主要是由于两性花资源多为‘双庆’后代，经杂交选育后，其后代的果粒数得到大幅度提高；雌能花资源多为野生资源收集而来，野生性状决定其营养生长势较强，叶片肥大，成熟时果粒较少，果穗较小，果粒松散，但果粒之间未由于数量减少而降低营养竞争，也是青粒率降低的原因之一。因此在选择杂交亲本进行品种选育时，建议选用青粒率较少的雌能花资源和两性花资源。

  3.2 果柄粗度与果粒滞育的关系

  葡萄浆果的干重与花梗直径存在相关性，干瘪浆果的果柄直径小于正常发育的浆果。通过在花后17d-29d的果粒标记动态观察，可以看出被标记的果粒发育情况显著滞后于未标记的果粒，在花后29 d时，大粒浆果体积已接近成熟时浆果体积，而被标记的中粒和小粒的体积始终处于停滞状态，至果实成熟期时不能继续膨大和着色（图A-1）。因此，可以根据果柄粗度对山葡萄不同类型果粒进行分级。

  3.3 ‘双丰’果实成熟的选择性

  葡萄果实发育成熟是具有选择性的，取决于品种的授粉花和幼果在受精次序、种子发育数、花粉来源等因素或是这些因素共同作用的基础上选择是否继续发育至成熟。最早受精的子房通常比后受精子房更容易成熟。基部花朵存在空间和时间优势，它们离叶片和根的距离近，从叶片和根部向上运输的养分都需要通过基部幼果，所以当资源有限时，离源较远的幼果发育最早受限。这些发育受限的小粒在内部生理作用和外力共同作用下易脱落，而中粒的养分受限稍迟于小粒，果柄和果粒已发生膨大，即使在外界因素的影响下也很难脱落。