无核材料创制岗位

  一、胚挽救幼苗继代扩繁原理与技术

  植株在生根成苗培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，这个过程叫做继代。一般将子叶变绿且张开的萌发胚转入成苗生根培养基上培养，待胚生根成苗培养1个月左右，选取株高为4—5cm，形成的主根为3—4条的试管苗效果较好。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态，从而发挥快速繁殖的优势。胚挽救幼苗继代培养中扩繁的方法是切割茎段，该方法常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物，简便易行，能保持母种特性。该阶段的培养主要使用的是1/2MS培养基。可同时满足成苗复壮和生根的需求。胚挽救幼苗扩繁的适宜时期可选择离体条件下一个月后，长势良好的具有根、茎、叶的完整植株。选材部位一般为带叶单芽茎段，接种在100mL或150mL的三角瓶中，单芽茎段最好选取植株中间部位，扩繁后能得到较健壮的植株，每株可扩繁至少3个单芽茎段。

  二、继代扩繁的材料、试剂与仪器

  （1）继代扩繁的材料

  继代扩繁的选材部位为单芽茎段，胚挽救杂中后代继代扩繁，无菌条件下，将试管苗在无菌的玻璃皿里切成带有腋芽的小茎段，然后插入新的继代培养基中。继代扩繁不能等试管苗叶片枯黄时再进行，继代是尽量选取植株生长旺盛的部位进行继代。

  （2）所用的化学试剂

  该继代扩繁阶段的培养主要使用的是1/2MS和WPM培养基，WPM培养基可同时满足胚的萌发和成苗过程。培养基主要成分为：1/2MS和WPM培养基、1mg/mL IAA、琼脂、蔗糖、活性炭、1M NaOH等。此外，胚挽救幼苗扩繁适宜的培养基主要成分为1/2×MS＋0.3 mg/L IAA+500 mg/L水解酪蛋白＋蔗糖20 g /L＋琼脂粉7g /L＋活性炭1.5 g /L，这个培养基上诱导生根效果较好，在灭菌前用1M NaOH调至培养基的PH值为5.8。恒温培养的温度一般为25~30℃，湿度的控制是通过保持培养室内的相对温度来实现的一般使三角瓶中的相对湿度保持为60~70%。光照强度40~50μmolm-2s-1，光照一般为16小时光照与 8 小时黑暗交替。

  （3）需要的实验仪器设备

  高压灭菌锅、超净工作台、酸度计、镊子、酒精灯、玻璃皿、滤纸、解剖刀、罐头瓶等。幼苗继代操作必须全程在超净工作台上、无菌条件下进行，操作前须对试验所用器具在紫外灯下照射30min消毒。继代完成后，将进行生根成苗的胚放置于组培间进行萌发培养，组培间的培养条件为：温度（25±2）℃，湿度50%~60%，光周期为12h/12h，光照强度2000 Lx~3000 Lx的。

  三、继代扩繁的操作步骤

  （1）继代扩繁培养基的配制，以1/2 MS为基础培养基，并添加0.3 mg/L IAA、30 g/L蔗糖、1.5 g/L活性炭、7 g/L琼脂，并用1M NaOH调至培养基的PH为5.8左右。在高压灭菌锅内121℃灭菌25分钟，之后在超净工作台里用罐头瓶进行分装。

  （2）在超净工作台上，无菌条件下，将培养了一个月左右的刚刚顶瓶盖的试管苗从成苗生根培养基中取出，在无菌的玻璃皿里切成带有腋芽的小茎段，然后插入适宜的继代培养基（1/2 MS + 0.3 mg/L IAA + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L琼脂 + 1.5 g/L活性炭）中。

  （3）将放入茎段的罐头瓶于培养条件为：温度（25±2）℃，湿度50%~60%，光周期为12h/12h，光照强度2000 Lx~3000 Lx的组培间中进行萌发培养。

  （4）继代培养1个月左右，试管苗的株高为4~5cm，形成的主根为3~4条效果较好。

  （5）此时在光强增强的培养间中闭口炼苗一周左右，移栽之前1～2天开盖炼苗。之后将试管苗移栽到配置好的经过高温灭菌的基质中，然后用装有无菌水的喷壶，喷洒整个试管苗，一方面为了增加试管苗的湿度，另外可以冲洗掉试管苗上附着的基质；用营养液浇灌刚移栽的苗子，浇透。再用一次性透明塑料杯子密封杂种幼苗。做好标记，把每个装有材料的营养钵放进大托盘中，最后把所有移栽好的材料放进炼苗室培养架上进行驯化。

  （6）胚挽救幼苗扩繁的适宜时期可选择离体条件下一个月后，长势良好的具有根、茎、叶的完整植株。选材部位一般为带叶单芽茎段，接种在100mL或150mL的三角瓶中，单芽茎段最好选取植株中间部位，扩繁后能得到较健壮的植株，每株可扩繁至少3个单芽茎段。

  （7）移栽后3-5天后开始逐渐降低湿度，增加光强。每5天轮流浇灌一次1/16MS营养液和多菌灵溶液，10-15天后逐步移开塑料杯，给试管苗一个从全封闭到半封闭最后到完全开放的一个环境变化的适应过程。

  （8）胚挽救幼苗在培养基扩繁培养的适宜时间为40天左右，待杂交幼苗的根长大于4cm、株高大于5cm以及至少5片叶子时生长成完整植株，再进行炼苗效果较好，且炼苗后成活率最高。炼苗前将培养试管苗的三角瓶置于日光温室中驯化锻炼7天左右。在试管苗移栽前1-2天将封口膜解开透气，锻炼试管苗的叶片气孔开合能力。使用混合基质（珍珠岩：草炭：园土=4:1:1）加水润湿后高温灭菌50min。移栽前先用无菌水洗去幼苗根部附着的培养基，将幼苗移栽到装有灭过菌的基质的花盆中，同时用800倍多菌灵和1/8MS营养液浇灌，加盖透明塑料杯保持湿度。移栽后3-5天后开始逐渐降低湿度，增加光强。每周交替浇灌一次1/16MS营养液和多菌灵溶液，10-15天后逐步移开塑料杯，给试管苗一个从全封闭到半封闭最后到完全开放的一个环境变化的适应过程。在温室驯化 30天后，移至大棚圃地里，按照田间管理的程序管理大棚圃地的移栽苗。第二年春天3月份左右定植大田。

  四、继代扩繁的注意事项

  （1）继代扩繁阶段培养基成分起到重要作用，培养基中激素配比不合适时容易形成畸形苗，造成杂种材料的损失。

  （2）继代扩繁不能到试管苗顶盖、叶片枯黄时再进行，应在试管苗刚刚顶到瓶盖时进行，继代是尽量选取植株生长旺盛的部位进行继代。

  （3）进行实验时，要保证整个实验过程是在无菌环境中进行的，如此才能减少材料的损失。