砧木评价与改良岗位
孙艳 赵胜建 郭紫娟 韩斌
摘要：为研究不同抗寒性葡萄品种根系形态结构及生理性状差异，从而为葡萄抗寒品种的鉴定、选育及抗寒栽培提供科学依据和技术支撑，以高度抗寒品种（左山一和贝达），中度抗寒品种（山河2号、5BB、SO4和1103P），抗寒性较弱品种（玫瑰香和红地球）根系为研究对象，通过测量骨干根角度，制作石蜡切片以观察其横切面解剖结构，测定总含水量和自由水含量，测定横切及纵切硬度及做功量，对根系角度、解剖结构、含水量及质地硬度等指标进行比较研究。结果显示：（1）不同抗寒性葡萄品种根系角度分布未呈现一定规律性；（2）高度抗寒品种左山一、贝达根系皮层比率、导管密度、导管直径、射线细胞大小等四项指标均小于其他品种，组织结构较其他品种紧密；（3）高度抗寒品种左山一、贝达总含水量、自由水含量及自由水含量/束缚水含量(自束比)等三项指标均低于抗寒性较弱品种玫瑰香和红地球，且差异显著（P＜0.05）；（4）高度抗寒品种左山一、贝达根系横切硬度、横切总功、纵切硬度及纵切总功四项指标均高于抗寒性较弱品种玫瑰香和红地球，且差异显著（P＜0.05）。研究表明，抗寒性强葡萄品种具有根系组织结构紧密，自由水含量高，自束比小，硬度及做功量大等特点，并且，根系横切总功可以作为方便、准确鉴定葡萄抗寒性的良好指标。
关键词：葡萄；根系；抗寒性；解剖结构；含水量；硬度；做功量
葡萄（Vitis vinifera L.）作为世界性的重要经济水果，因其具有适应性强，产量高，经济效益显著等优点，受到我国许多地区果农的广泛青睐，成为我国农业产业化的一个重要组成部分。我国的葡萄产地主要分布在北方地区,但近年来该地区冬季极端低温频发[1]，使葡萄遭受到不同程度的低温伤害，给果农造成了巨大损失，严重阻碍了葡萄产业的发展。葡萄的抗寒性是指葡萄在越冬期间对零度以下温度的忍耐能力[2-3]，是葡萄对低温寒冷环境长期适应过程中通过本身遗传变异和自然选择获得的[4-5],属于葡萄重要的生物学特性［6］。葡萄不同种和品种的抗寒性不同，不同器官的抗寒性也表现出极大差异，根系作为葡萄抗寒性最差的器官[7-9]，其抗寒性强弱对葡萄能否安全越冬起到了决定性作用，因此，研究葡萄根系的抗寒性，准确评价其抗寒相关性状，对葡萄栽培品种的选择具有重要实际意义。
关于葡萄抗寒性的鉴定方法及抗寒生理指标的选择方面已多有报道，电导率法是目前葡萄进行抗寒性鉴定较为可靠的方法之一，相对电导率大小与葡萄的抗寒能力呈负相关[10-11]。此外发芽率、生根率、褐变指数、丙二醛、脯氨酸和淀粉含量等都可以作为葡萄抗寒性鉴定的筛选指标。如李桂荣等[12]发现低温胁迫使葡萄枝条中丙二醛和可溶性糖含量均逐渐增加。樊秀彩等[13]通过统计田间受冻害葡萄春季萌芽数量以考察不同品种抗寒性，得到了90个抗寒性极强的品种资源。Lindén等[14]指出，检测植物组织的水分状况是植物抗寒生理研究的重要部分。Viands D R[15]和刘志鹏等[16]研究了苜蓿根部抗寒的形态机理，指出其根系形态与抗寒性间有密切关系，分枝型苜蓿比直根型苜蓿具有更强的抗寒性。然而，截至目前，关于葡萄根系形态和抗寒性的关系则未见报道，对葡萄根系质地硬度与抗寒性关系的研究也相对空白[17]。在评价葡萄抗寒性指标方面，国内外尚无统一的测定方法，有关不同葡萄品种根系形态结构、生理特性和质地硬度相结合的系统研究报道更为少见。本试验以8个抗寒性不同的葡萄品种为试材，对其休眠期间根系角度、解剖结构、含水量及质地硬度差异等指标与抗寒性的关系进行探讨，进一步阐明葡萄抗寒的生理基础，为葡萄抗寒品种的鉴定、选育及抗寒栽培提供科学依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试品种均取自河北省农林科学院昌黎果树研究所葡萄资源圃，栽培管理条件一致，包括高度抗寒品种：左山一(Vitis amurensis Rupr.)，贝达(Vitis riparia × Vitis labrusca)，中度抗寒品种：山河2号(Vitis amurensis × Vitis riparia )，5BB(Vitis berlandieri × Vitis riparia)，SO4(Vitis berlandieri×Vitis riparia)，1103P(Vitis berlandieri × Vitis rupestris)，抗寒性较弱品种：玫瑰香(Vitis vinifera L.)，红地球(Vitis vinifera L.)，不同组分间抗寒性差异显著[18-19]。以1年生扦插苗成熟根系为试材，每个品种选取生长势基本一致的50棵植株，试验于2017年11月进行。
1.2 试验设备
CT3质构分析仪：美国Brookfield公司；GDJS-500L高低温交变试验箱：江苏无锡索亚特试验设备有限公司；雷磁DDS-11A型电导率仪：上海仪电科学股份有限公司；切片机：江苏常熟科学仪器厂；KD-T电脑生物组织摊烤片机：浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；奥林巴斯BX51显微镜：日本奥林巴斯有限公司；海尔BCD-137TMPA低温冰箱：青岛海尔股份有限公司；2WAJ阿贝折光仪：上海光学仪器五厂。
1.3 试验方法
1.3.1 电导率测定
预处理：以1年生扦插苗根系为材料，将根剪下后用自来水冲洗以除去表面泥沙，剪去须根，选取粗度为2.0-3.0mm的根段。用去离子水反复冲洗，晾干，剪成4.0-5.0mm长的根段，放入10mL离心管，加盖，置于0℃冰箱保存。参照前人的研究结果以-9 ℃作为最佳冷冻处理温度进行低温处理[20-21]。处理过程如下：以4 ℃/h的降温速度将温度降至预设温度，在预定温度下保持4 h，以4 ℃/h的速度升温到4 ℃，然后放在4 ℃的冷藏冰箱中待测定，低温处理采用高低温交变试验箱。
根段切成2.0-3.0mm 长的小段，称取1.00 g置于30 mL带刻度试管，加入去离子水25 mL，加盖，置20-23℃下保温24 h。保温期间用手震荡1-2次。用电导率仪测定浸出液电导率（C1），然后煮沸20 min杀死组织，静置3-4 h至室温测定电导率（C2）。每个品种重复三次测定。
电解质渗出率/%= C1/C2×100
1.3.2 根系角度的测量
将葡萄植株挖出，统计骨干根总数，用量角器测量骨干根（2.0mm<Φ<5.0mm）角度，以根系与主干延伸方向形成的夹角大小来衡量根系类型[22],以夹角小于40°归为垂直根, 以夹角大于 70°归为水平根, 介于两者之间的则归为倾斜根，每个品种测量50棵植株。
1.3.3 根系解剖结构的观察
将各品种葡萄根系洗净去除须根后选取粗度为2.0-3.0mm的根段，剪成4.0-5.0mm长，采用李正理[23]石蜡切片法进行切片制作,按照如下步骤进行：固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→修蜡块和粘蜡块→切片→展片与粘片→脱蜡→染色→封片。然后，将晾干后的载玻片置于显微镜下观察、照相，并对射线细胞大小（长×宽）、导管直径和皮层厚度等指标进行测量。每个品种随机选择5个根段进行处理。
1.3.4 根系含水量的测定
总含水量、自由水含量的测定参照高俊凤[24]的方法。
束缚水含量=总含水量－自由水含量
1.3.5 根系硬度及做功量的测定
选取粗度为2.5±0.2mm左右成熟根段，洗净将外表水分吸干，剪成长度5.0±0.3mm左右，放置于质构仪测试平板上，然后采用刀片探头TA-CKA对根段进行压缩模式测试。横切即刀片垂直于根系延伸方向，纵切即根系延伸方向垂直于测试平板。测试参数如下：触发点负载5g，测试速度0.7mm/s，返回速度0.7mm/s，数据频率：10points/second，根系横切目标值：2.0mm，纵切目标值：1.0mm，分别测定横切及纵切过程中的根系硬度及做功量。每个品种横切和纵切分别选取20段根系进行测定。由质地特征曲线得到根系质地参数：硬度及做功量。
1.4 数据统计
利用Microsoft Office Excel 2016软件进行数据处理，并绘制柱形图，采用SPSS 17.0软件对差异显著指标进行Duncan 多重比较。
2 结果与分析
2.1 8个葡萄品种根系相对电导率
植物细胞电解质的外渗程度可用相对电导率来表示，反映植物细胞膜系统的低温伤害程度［25］。电导率值越大，表明植物组织细胞电解质透过细胞膜的通透性越大，即植物抗寒性越弱[26]。由图1可以看出，左山一和贝达根系相对电导率值较小，分别为41.49%和42.86%，两者间差异不显著,与其他品种间均呈差异显著水平。山河2号、5BB、SO4和1103P根系的相对电导率在45%-55%。玫瑰香和红地球根系相对电导率值较大，分别为72.9%和75.98%，两者间差异不显著，与其他品种间差异显著。
2.2 8个葡萄品种根系角度
植物根系类型与其抗寒性有一定关系[27]。而本试验通过对8个葡萄品种骨干根分枝角度进行测量，结果显示（表1），抗寒性较强品种左山一和贝达分枝角度与抗寒性较弱品种玫瑰香和红地球间差异均不显著（P＞0.05）。抗寒性较弱品种红地球垂直根所占比例最大，为50%，倾斜根所占比例最小，为38.89%；抗寒性中等品种5BB垂直根所占比例最小，为7.69%，水平根所占比例最大，为11.54%；抗寒性中等品种SO4倾斜根所占比例最大，为85.00%；抗寒性中等品种1103P水平根所占比例最小，为0。可见，抗寒性不同葡萄品种根系角度分布未呈现一定规律性。
2.3 8个葡萄品种根系解剖结构
葡萄根系解剖结构与其抗寒性有一定关系[28]。通过观察比较发现，抗寒性不同葡萄品种根系组织结构差异较大。由表2可以看出，左山一射线细胞、导管密度及导管直径均最小，贝达皮层比率最小，玫瑰香和红地球射线细胞、皮层比率、导管密度及导管直径均显著高于左山一和贝达。左山一和贝达2个品种射线细胞较小且数目较多，组织结构较紧密，因而形成了更明显的髓射线，导管较小且数目较少，并且在木质部边缘分布较少，这些结构特征说明了左山一和贝达具有更高的抗寒性；而抗寒性较弱的品种玫瑰香和红地球射线细胞较大且数目较少，组织结构较疏松，导管较大且数目较多，分布可达到木质部边缘。
2.4 8个葡萄品种根系含水量
通过对8个葡萄品种根系含水量进行测定，结果显示（表3），抗寒性不同品种间总含水量、自由水含量及自由水含量/束缚水含量（自束比）三项指标差异显著。其中，总含水量由高到低排序为：红地球>玫瑰香> SO4>5BB >1103P >山河2号>贝达>左山一；自由水含量由高到低排序为：红地球>玫瑰香> SO4>1103P > 5BB >山河2号>贝达>左山一；贝达束缚水含量最高，为15.41%，红地球束缚水含量最低，为10.94%，二者束缚水含量差异显著；左山一和贝达自由水含量与束缚水含量比值较小，分别为2.44和2.42，与其他品种间差异显著，山河2号、1103P、5BB和SO4自束比比值分布在3.19-3.69，且与其他品种间差异均显著，玫瑰香和红地球自束比比值较大，分别为4.35和5.94，且与其他品种间差异显著。
2.5 8个葡萄品种根系硬度及做功量
根系硬度及做功量代表了根系在外力的切割作用下抵抗断裂的能力。通过对8个葡萄品种根系硬度进行测定，结果显示（表4），不同品种根系硬度和做功量均存在较大差异。其中，左山一根系横切硬度、横切总功、纵切硬度和纵切总功均为最大，分别为3441.70 g、38.52 mJ 、1353.50 g和8.81 mJ,且后三项指标与其他品种间差异显著；红地球根系横切硬度、横切总功、纵切硬度和纵切总功均为最小，分别为2150.10 g、22.00 mJ 、724.80 g和4.73 mJ，且后两项指标与其他品种间差异显著；不同品种按横切硬度和横切总功从大到小排序均为：左山一＞贝达＞山河2号＞1103P＞5BB＞SO4＞玫瑰香＞红地球；不同品种按纵切硬度从大到小排序为：左山一＞贝达＞山河2号＞1103P＞SO4＞5BB＞玫瑰香＞红地球；不同品种按纵切总功从大到小排序为：左山一＞贝达＞SO4＞山河2号＞1103P＞5BB＞玫瑰香＞红地球。
2.6 葡萄根系生理指标相关性分析
对葡萄根系14个抗寒指标进行相关性分析，得出其各抗寒指标的相关系数矩阵（表 5）。由表5可以看出，根系电解质渗出率与皮层比率和射线细胞大小间均呈极显著正相关（r=0.816， r=0.896），与总含水量、自由水含量及自束比间均呈极显著正相关（r=0.945， r=0.946， r=0.898），与横切总功、横切硬度、纵切总功和纵切硬度间均呈极显著负相关（r=-0.880， r=-0.817， r=-0.757， r=-0.783）,而与根系角度间相关性较弱（r=-0.210）。射线细胞大小与横切总功、横切硬度、纵切总功和纵切硬度间均呈极显著负相关（r=--0.843， r=-0.787， r=-0.674， r=-0.719）。总含水量与横切总功、横切硬度、纵切总功和纵切硬度间均呈极显著负相关（r=--0.811， r=-0.750， r=-0.734， r=-0.765）。
3 结论与讨论
3.1 葡萄根系角度与抗寒性
植物根系形态影响着其对逆境的抵抗能力[29-30]。目前，有关植物根系形态与抗寒性关系的研究主要集中在草本作物上，刘志鹏等[16]指出，苜蓿根系形态与抗寒性密切相关，抗寒性不同的品种根系类型差异显著，分枝型根系比单个直根更能更好的忍受冻害；孙波等[27]观察发现，抗寒性强的甘蔗品种根系分枝角度小，呈向下生长趋势，而抗寒性弱的品种根系分枝角度大，呈平周生长趋势。本研究结果显示，8个葡萄品种根系角度与其抗寒性间未呈现一定相关性，抗寒性较弱的红地球葡萄品种垂直根所占比例分别为50%，抗寒性较强的左山一葡萄品种垂直根所占比例为13.64%，与前人研究结论不一致。这可能与材料处理时期有关。研究指出，葡萄根系的形态特征受到一系列对根原基进行负调节的基因型控制[31-32]，不同品种有不同的抗寒基因存在,这些抗寒基因只有在特定时期，特定条件下才能被激活，从而诱发根系表达出不同的形态结构以抵御逆境[33-34]，而这种适应性变化存在明显的基因型差异[35]。本试验中葡萄根系随着地温逐渐降低进入休眠，而不同葡萄品种根系对温度变化敏感程度不同，左山一、贝达等葡萄根系感受到的低温环境可能不足以诱发控制根系形态的抗寒基因表达造成其垂直根比例较低。根系的形态建成也受到地上部生长的影响。潘晓华等[36]报道指出，根冠的生长方向受地上部向根系输送碳水化合物的影响，地上部光合强度高，则直下根和斜下根比例增加，反之则水平方向生长的根增加。由于不同葡萄品种地上部光合特性可能存在一定差异，从而造成本试验中1103P和SO4葡萄垂直根和倾斜根比例较大，而水平根比例较小，左山一和贝达葡萄垂直根和倾斜根比例较小，而水平根比例较大。抗寒性不同葡萄品种根系形态建成有关影响因子仍需进一步研究。
3.2 葡萄根系解剖结构与抗寒性
葡萄根系形态解剖结构的形成是对环境长期适应的结果，与品种抗寒性密切相关。本研究发现，高度抗寒葡萄品种左山一和贝达根系具有组织紧密，射线细胞小，皮层比例低，导管小而密度低的结构特点，与抗寒性较弱品种红地球和玫瑰香之间差异显著。因此，根系解剖结构特征可作为葡萄品种抗寒性鉴定的指标之一。本结果与郭修武[37]的研究结果基本一致。射线细胞体积小，排列紧密，不仅有利于水分经较短距离迁出细胞，减少细胞内结冰[38]，还可以贮藏大量营养物质，营养物质对寒害有一定的防御功能[39]。木质部导管直径小，则树液结冰造成的木质部栓塞化程度低[40-41]，使得木质部能够保持一定的水分疏导功能，从而减轻胞外结冰带来的伤害，且有助于葡萄植株在受冻后的解冻过程中快速恢复疏导能力[42]，从而恢复正常生理代谢。因此，导管直径小这一结构特性对于抗寒植物尤为必要。
3.3 葡萄根系含水量与抗寒性
植物组织内的水分主要以自由水和束缚水两种状态存在，自由水不与原生质体紧密结合，主要存在于细胞间隙，可以自由移动，束缚水则相反[43]。束缚水是细胞内亲水性大分子物质强行结合的水,对维持原生质体胶体稳定具重要作用[44]。葡萄根系含水量特别是自由水含量低，细胞液浓度髙，生理代谢活动弱，有利于增强树体抵御冻害的能力。本试验证实，抗寒性不同的葡萄品种同一休眠时期根系含水量存在一定的差异，高度抗寒品种左山一和贝达表现为根系总含水量和自由水含量较低，自由水与束缚水含量比值较小，与抗寒性较弱品种玫瑰香和红地球间差异均显著。Lyons指出，由于当冻害发生时，细胞间隙中的水首先结冰形成冰核，随着低温的延续，结冰逐渐扩大，原生质内的水向细胞间隙渗透，造成细胞严重脱水，细胞膜皱缩，同时结冰又会对细胞膜进行挤压，细胞膜受到机械损伤[45]。当冬季气温降至0°以下时，细胞间隙的自由水便开始结冰，而束缚水的冰点在-20℃～-25℃以下[46]，远低于自由水。因此当束缚水的相对含量较高，自由水的相对含量较低时，结冰温度相应降低。相反，当自由水束缚水比值高时，葡萄根系生理代谢活动比较旺盛，抗寒性较差。陈佰鸿[47]的研究也证明了根系的含水量与其抗寒性关系密切。
3.4 葡萄根系硬度与抗寒性
本试验研究结果显示，根系硬度及做功量与射线细胞大小呈极显著负相关，射线细胞越小，组织排列越紧密，则根系硬度及做功量越大，反之则根系硬度及做功量越小。根系木质部细胞细胞壁较厚，为根系提供了主要的结构支撑。纤维素、半纤维素、木质素和果胶质作为细胞壁的主要组成成分，关系着植物细胞机械组织的发达程度[50]，进而影响着根系硬度。前人研究指出，细胞壁中纤维素、半纤维素及果胶质的含量变化与果实软化密切相关[51-52]。细胞壁中较多的纤维素和木质素含量能够增加种皮的机械强度和坚硬度 [53]。牢固的纤维素结构使细胞壁具有高强度性能，木质素使细胞相连，增加细胞壁的抗压强度，强化植物组织[54],半纤维素与纤维素微纤丝结合，而果胶质则分布在半纤维素和纤维素微丝中并与之紧密交联，形成复杂的网络结构，对细胞壁的结构起到加固的作用[55]。抗寒性较高品种左山一和贝达，射线细胞较小，排列紧密，纤维素、木质素等细胞壁组成物质相对含量增加[56]，因此硬度较抗寒性弱的品种大。根系硬度及做功量与总含水量均呈极显著负相关，总含水量越少，根系硬度及做功量越大，反之则根系硬度及做功量越小。前人报道指出，冬季根系水分含量少，但根系抗拉强度却较夏季大，可能原因在于冬季根系含水量低[57]。高甲荣等[58]和蒋坤云等[59]研究指出，根系含水量越高，细胞壁纤维韧性降低，在遇到外力作用时其抵抗断裂的能力就越弱，与本研究结论相似。根系解剖结构与含水量影响了根系硬度和抗寒性,而本试验中葡萄根系硬度和做功量与抗寒性间均呈较好的相关性，根系横切总功与电解质渗出率间相关系数为-0.880，因此，葡萄根系横切总功可以作为鉴定不同葡萄品种抗寒性的良好指标。