生物防治与综合防控岗位

周连柱 孔繁芳 王忠跃

  葡萄霜霉病是世界和我国葡萄生产中危害最为严重的一种卵菌病害。该病可危害葡萄的所有绿色幼嫩组织，主要包括叶片、嫩枝、新梢、花序、幼果等。侵染后造成叶片焦枯早落、树梢扭曲变形、花序干枯死亡等，严重阻碍葡萄叶片的光合作用、影响树体的健康生长和葡萄果实营养的贮藏，最终造成产量和品质的下降，并且该病害传播迅速，病害流行时危害巨大。生产上防治该病害的措施很多，其中最普遍最有效的方法还是使用化学杀菌剂。随着药剂的普遍频繁使用，病菌对药剂敏感性下降，导致杀菌剂的防效下降。甲霜灵（metalaxyl）属于苯基酰胺类杀菌剂，是该类杀菌剂中使用最为频繁和普遍的一种药剂，该杀菌剂与同类杀菌剂之间存在交互抗性，抗性风险高且能够稳定遗传。我国葡萄霜霉病菌对甲霜灵已普遍产生了抗性。为治理甲霜灵的抗性问题，本研究拟采用叶片漂浮法检测以上三个葡萄主产区霜霉病菌对甲霜灵的抗性，通过分析其抗性频率及抗性水平，明确田间抗药群体的发生发展动态，为葡萄霜霉病的科学防治、甲霜灵药剂的抗性治理以及苯基酰胺类杀菌剂的恢复使用提供科学的指导。

  1  材料和方法

  1.1  试验材料

  1.1.1 供试药剂

  87%甲霜灵原药由先正达（中国）投资有限公司提供。

  1.1.2 接种材料

  试验中接种材料为葡萄霜霉病菌感病品种‘里扎马特’，采自中国农业科学院廊坊中试基地，摘取当年生副梢顶端第4~5片的健康嫩叶。

  1.1.3 供试菌株

  于2017年间，在葡萄生长季节收集了我国云南省宾川县、湖北省公安县和山东省烟台市三个主要葡萄产区霜霉病样，通过分离纯化后得到127株葡萄霜霉病菌（表1）。此外，另两株命名为PV和YQ的葡萄霜霉病菌株为本实验先前获得的，对甲霜灵药剂敏感性明确的葡萄霜霉病菌株。其中，PV为甲霜灵敏感型菌株，YQ为甲霜灵抗性菌株。

  1.2 试验方法

  1.2.1 葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗性检测

  采用叶盘漂浮法进行抗药性检测。将事先配制好的50 mg/mL甲霜灵母液用无菌水稀释至所需浓度，加入至直径9 cm培养皿中，稀释后供试药剂浓度为10、100 μg/mL，每皿20 mL药液，以灭菌水加入相同体积的溶剂作为对照。将供试的‘里扎马特’健康嫩叶在室内用清水清洗干净叶面上的尘土，在1%次氯酸钠溶液浸泡30 s后用无菌水冲洗3遍，再用灭菌的滤纸将叶片表面的水滴吸干净，在超净台中用灭菌的打孔器制成直径为15 mm的叶盘，将其叶背面向上漂浮于配制好的药液中，每皿10个叶盘，每个浓度3个重复。将分离纯化得到的新鲜孢子囊用无菌水洗脱后配制成浓度为1×105个/mL 孢子囊悬浮液，用移液枪滴在叶盘中央，每个叶盘10 μL，试验中以敏感菌株PV作为阴性对照，抗性菌株YQ作为阳性对照，相同体积无菌水作为空白对照。置于温度为21℃，相对湿度为100%，16/8 h光暗交替的人工气候箱中培养。对照组中，阴性对照菌株PV仅在空白对照组中发病，在其他药剂浓度下不发病；阳性对照菌株YQ同时在空白对照组和两个药剂试验组中均发病，视为试验正常，否则视为试验失败。待所用对照组正常发病后，调查记录供试菌株的发病情况。

  1.2.2 葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗性水平及抗性类型

  根据Fourie等人的研究结果，葡萄霜霉病菌对甲霜灵的最小抑制浓度（MIC）值为0.1 μg/mL并以此为敏感菌株参考标准，根据Stahle-Csech的抗性倍数检测标准，抗性倍数（RF）=（检测菌株的MIC值/敏感参考菌株的MIC值），RF > 100即代表产生了抗性。并且定义当检测菌株MIC = 1 μg/mL，RF = 10时为敏感菌株；当MIC = 10 μg/mL，RF = 100时为低水平抗性；当MIC ≥ 100 μg/mL，RF ≥ 1000时为抗性。

  2 结果与分析

  2.1 葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗性频率

  本研究采用叶盘漂浮法测定了我国云南省宾川县 、湖北省公安县和山东省烟台市3个地区127株葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗性情况（表2）。检测的3个地区127株葡萄霜霉病菌中抗性菌株91株，整体抗性频率较高，达71.7%。但不同地区间病菌的抗性频率存在明显差异，抗性频率最高（92.0%）和最低地区（29.6%）相差较大。

  2.1 葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗性水平

  将检测的127株葡萄霜霉病菌进行抗性水平划分，各地区葡萄霜霉病菌对甲霜灵的不同敏感型占比如表3所示。127株葡萄霜霉病菌中敏感型菌株36株，占总检测菌株的28.3%，低水平抗性菌株48株，占37.8%，抗性菌株43株，占33.9%，病菌整体以低水平抗性和抗性类型为主，整体抗性水平较高。不同地区霜霉病菌的抗性水平不同，且抗性频率较高的地区其抗性水平也存在较大的差异。山东省烟台市葡萄产区霜霉病菌的整体抗性水平较低，病菌以低水平抗性为主，占该地区检测菌株的64.0%，抗性菌株占10.0%，抗药性风险较高；而湖北省公安县葡萄产区霜霉病菌的抗性频率和抗性水平均较高，病菌多为抗性类型，占该地区检测菌株的76.0%，低水平抗性菌株占16.0%，敏感型菌株占8.0%，抗药性较为严重；云南省宾川县葡萄产区霜霉病菌的抗性频率和抗性水平均较低，病菌以敏感型为主，占70.4%，低水平抗性菌株占29.6%，无抗性菌株。

  3 结论

  本研究明确了我国云南省宾川县、湖北省公安县和山东省烟台市3个地区葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗性情况，测定的127株葡萄霜霉病菌中敏感型菌株占28.3%，低水平抗性菌株占37.8%，抗性菌株占33.9%，病菌整体以低水平抗性和抗性类型为主。不同区域葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗性情况存在差异，可能与该地区甲霜灵的限制使用有关，对于本研究中湖北省公安县和山东省烟台市等病菌抗药性严重及抗药性风险较高的地区，应停止甲霜灵的使用，选择其他无正交互抗性的替代药剂，避免抗药性问题进一步发展；而对于云南省宾川县病菌抗性频率和抗性水平较低的地区，可根据甲霜灵的使用建议，继续科学合理地使用。