石家庄综合试验站
NAC转录因子是近10年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子，为植物中最大的转录因子家族之一。近年的研究表明，NAC 转录因子对果实发育及成熟过程起到重要的调控作用。本课题先前在维多利亚转录组测序得到的数据中，发现11个NAC转录因子可能参与果实的发育成熟。本研究在此基础上，以金星无核、红巴拉多、红地球为试材，对当前已经报道的74个NAC转录因子进行系统分析，发掘与果实成熟相关的转录因子，对果实成熟机理进行深入研究，为揭示果实成熟发育调控及其机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1植物材料
试验于2020年在石家庄果树研究所葡萄示范园进行。试材为金星无核、红巴拉多、红地球葡萄，栽植于连栋大棚，南北行向栽植，行间自然生草，田间肥水与病虫害防治按照葡萄园常规管理措施进行管理。选择树势中庸的植株，各品种选择花期相近的果穗标记并进行花序整形，每结果枝留一个果穗并后期整穗疏果，保证穗型一致。田间管理按照葡萄园常规管理措施进行。本研究采集不同品种不同发育时期的果实，于5月29日进行第一次采样，每隔10天采样1次，直至成熟。每次选取3穗果实，均匀从每穗上中下剪取果粒，测定单果重，然后随机抽取50-70粒果实存放于自封袋内，做好标记，液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存备用。
1.2试验方法
1.2.1果实理化性质分析
随机选取20粒果实，利用电子天平称重并求得单果重量。
利用高效液相色谱技术检测葡萄果实糖分物质，参考王海波等人的方法，略有改动。随机选取10粒果实利用粉碎机打成匀浆，并用纱布过滤，抽取5mL果汁8000r/min离心10min，上清液备用。糖提取：吸取1ml上清液，水稀释10倍后，经0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，待测。利用色谱柱为ZORBAX Carbohydrate（4.6×250mm，5μm），流动相为乙腈—水（85:15）溶液，柱温30℃，流速为0.8ml/min，进样量10μL。检测器为示差检测器。试验所用葡萄糖、果糖、蔗糖均购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（TCI）。
花色苷的测定参考杨夫臣等的方法，并略有改动：准确称取液氮研磨的果皮粉末1g，以预冷的1%盐酸-无水甲醇溶液（pH=2）作为浸提液，4℃遮光浸提1h，4800rpm离心10min，吸取上清液，冲洗沉淀2次，定容到50ml待测。以1%盐酸-无水甲醇溶液作空白参比调零，选取巨峰定容后的溶液，测定450～600nm的吸收光谱，确定巨峰葡萄色素的最大吸收峰，并测定各溶液的吸光度值，重复3次。葡萄果皮中花色素含量的计算参照张昭其的方法:花色素含量 (mg/g)=A×V×1000×455.2/29600×d×m式中: A:最大吸收波长处吸光度值;V:定容体积(L);1000:g换算成mg扩大的倍数;455.2:矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子质量(g/mol);29600:矢车菊素-3-葡萄糖苷的浓度比吸收系数(L/mol·cm);d:比色杯光径(cm);m:鲜质量(g)。
1.2.2 NAC转录因子的表达分析
从植物转录因子数据库PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）下载已发表的74个NAC转录因子，采用在线设计工具Primer-BLAST设计表达引物，由生工生物工程上海股份有限公司合成。
以红地球不同发育时期的果实为试材，利用植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取果皮的总RNA。用1.0%凝胶电泳检测RNA质量。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Thermo scientific公司）将提取的RNA反转录成cDNA，-20℃保存。
以红地球不同时期的cDNA为模板，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行PCR扩增。qPCR 体系为：cDNA模板3.5μL，上下游引物各0.4μL，Mix10μL，ddH2O 5.7μL。qPCR程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃延伸1min，共循环40次，在65℃-95℃进行溶解曲线分析。以actin的表达水平为内参，基因的相对表达量按ABI7500荧光定量仪使用说明进行分析。以红地球5月29日表达量作为对照，即表达量为1，数据使用Origin 9.0软件进行处理。
1.2.3候选NAC转录因子的序列分析
从植物转录因子数据库PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）下载候选11个NAC转录因子的氨基酸序列，蛋白质基本性质用Protparam（http：//au.expasy.org/tools/protparam. html）预测；TMHMM 2.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构域；SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽。通过NCBI与查阅文献获得的20个NAC基因，利用使用MEGA 5.0软件构建系统进化树，bootstrap检测设置重复为1000次。
1.2.4候选NAC转录因子的验证
筛选出红地球葡萄不同时期表达差异的NAC转录因子，检测其在金星无核、红巴拉多果实的表达情况，qPCR体系同1.2.2，以各个品种第一次采样果实表达量作为1，数据使用Origin 9.0软件进行处理。
2 结果与分析
2.1果实的理化性质分析
在红地球果实坐果到成熟过程中，单果重呈逐渐增加的趋势，前期增长速度较快，直到7月19日（T6）左右趋于稳定。如图1所示，葡萄果实中检测到的糖分物质主要为葡萄糖、果糖，含量随着果实发育逐渐提高，于6月19日-29日（T3-T4）开始出现快速增加，直至成熟。成熟果实中果糖与葡萄糖的含量近乎一致。 红地球果实随着果实逐渐着色，果皮色素含量随之升高，与6月19-29日（T3-T4）之间色素开始逐渐积累，直至成熟。
2.2 NAC转录因子的表达分析
为明确NAC转录因子与果实发育成熟的关系。本研究以红地球各个发育阶段的果实cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR技术对NAC家族的74个转录因子的表达量进行分析。结果显示（图2），筛选出11个转录因子在果实发育过程中的出现表达差异。其中，NAC74表达量变化最大，其次为NAC13、NAC11、NAC47等转录因子。另外，由图可知，11个转录因子主要是2种不同的表达模式。部分NAC转录因子（NAC17、NAC19、NAC33、NAC47、NAC61）于发育中期出现表达高峰，但随着成熟出现逐渐降低；另一种（NAC5、NAC13、NAC20、NAC74）随着果实发育成熟逐渐升高或者持续高表达。综上所述，推测11个转录因子可能与果实发育成熟密切相关。
2.3 候选NAC转录因子的基本结构分析
除NAC17、NAC18与NAC33共同分布在19色染色体上之外，其余8个NAC转录因子在葡萄基因组不同的染色体上。11个NAC蛋白氨基酸数量幅度在199（NAC47）到560（NAC20）之间。各蛋白分子量与等电点各有不同。另外。NAC20、NAC26、NAC47、NAC61不稳定系数均小于40，说明其稳定性较好，其余7个NAC蛋白的不稳定系数高于40，稳定性不佳。11个NAC蛋白总平均亲水性（GRAVY）均为负值，说明各个NAC蛋白具有亲水性，为亲水性蛋白。使用TMHMM 2.0在线软件识别分析11个转录因子的跨膜螺旋，除NAC20存在一个跨膜区域（530aa-552aa）外，10个NAC蛋白均不存在跨膜区域。利用SignalP在线软件分析预测11个NAC转录因子的信号肽，发现均不含有信号肽序列，推测该蛋白不是分泌蛋白。
为研究葡萄NAC转录因子的生物学功能，本研究通过NCBI与查阅文献获得20个NAC基因，构建了包括拟南芥、水稻、番茄、矮牵牛、马铃薯、橙、苹果、葡萄等多种植物的系统进化树。结果如图所示，NAC17与众多参与胁迫响应的NAC转录因子聚到一起，例如ATAF1能够增强对白粉病的抗性，却不同程度地减弱了对细菌性叶斑病灰霉病以及黑斑病的抗性；OsNAC6 可明显增强水稻对稻瘟病的抗性；SlNAC1受盐胁迫诱导且提高耐寒性。可见，NAC17可能参与葡萄的生物胁迫响应机制。NAC29、NAC18与众多调控果实成熟衰老及叶片脱落相关基因NOR、NOR-like1、CitNAC、AtNAP等基因聚到一起，NAC47与苹果果实乙烯生成的负调控因子MdNAC78聚到一起，NAC11与苹果果实乙烯生成的正调控因子MdNAC80聚到一起，由此可推测均参与果实的发育成熟。具有相似结构和功能的 NAC 蛋白倾向于聚类到一起，为研究葡萄NAC基因功能提供参考。
2.4 候选NAC转录因子的验证
本研究检测了11个候选基因在金星无核与红巴拉多果实发育成熟过程的基因表达情况。结果显示，11个转录因子在两个葡萄果实发育成熟过程中均表达出现差异。其中，金星无核果实中NAC5、NAC11、NAC13、NAC17、NAC47、NAC61、NAC74表达变化较大，红巴拉多果实发育过程中，NAC5、NAC11、NAC13、NAC18、NAC33表达变化较大。
3 结论
本研究系统研究了NAC转录因子家族在果实发育成熟过程的作用。以金星无核、红巴拉多、红地球为试材，发掘与果实成熟相关的转录因子。结果表明11个NAC转录因子在葡萄果实发育成熟过程中表达出现差异，推测可能参与葡萄果实发育成熟过程。