种苗扩繁与生产技术岗位
刘瑶 王军
葡萄酒拥有悠久的历史，深受人们的喜爱，其浓郁复杂的香气和丰富的口感给人们带来了感官的享受和心灵的愉悦。葡萄酒风味是判断葡萄酒品质的重要指标。作为一种发酵饮品，微生物赋予了葡萄酒中最主要的发酵香气。一款品质好的葡萄酒通常是结构复杂且协调、果香浓郁、平衡性好、回味绵长以及具有原产地典型性。风味的复杂平衡和典型性至关重要。大量研究表明，相比于单纯酿酒酵母菌发酵，混合发酵产生的挥发性物质种类和含量更多，风味更协调多样，更能体现酿酒葡萄种植地的风土。事实上，利用原生酵母自然发酵在许多传统葡萄酒产区仍是发酵葡萄酒，尤其是红葡萄酒的常规方法，天然酵母被视为葡萄园“风土”的一部分。酵母菌在本地区气候条件、土壤状况、酿造工艺影响下，经过长期自然驯化和选择，与葡萄品种通过影响葡萄酒的风味物质种类、含量和比例，从而形成本地区葡萄酒的典型特点。在新世界葡萄酒产区，商业化酿酒酵母菌由于其生产过程稳定可控而应用广泛，但缺乏典型性。随着对非酿酒酵母在改善葡萄酒香气、口感、颜色等品质方面认识的加深，越来越多的商业化非酿酒酵母被应用到葡萄酒发酵上。根据葡萄品种、气候条件、酿造工艺和对葡萄酒的感官目标选择合适的非酿酒酵母品种、数量、接种方式和比例，可以在保证生产过程可控的同时生产出品质优良、具有鲜明特色的葡萄酒。
葡萄酒混合发酵研究首先从微生物的角度探究混合发酵过程中不同酵母菌的生理代谢活动过程和相互作用，分析由此产生的代谢物，一些物质对葡萄酒品质有直接的影响，如代谢酶、挥发性物质、醇类、有机酸等；一些物质通过调节微生物活动或与葡萄化学成分的反应来发挥作用。混合发酵研究从细胞和分子层面揭示了不同酵母菌种在混合发酵中的代谢过程、特点，以及葡萄酒品质如何随之发生变化，解释了混合发酵改善葡萄酒品质的生物化学原理，为混合发酵实际应用和操作提供了理论基础。
1 混合发酵对葡萄酒感官品质的影响
非酿酒酵母菌和酿酒酵母混合发酵对葡萄酒品质的影响不一。许多非酿酒酵母产酯类能力强，可以改善葡萄酒香气。而有些酵母菌发酵会产生不良风味（挥发性脂肪酸、含硫化合物、羰基化合物）。因此，要根据葡萄品种、酿造工艺和陈酿条件选择适合的混合发酵菌种来改善葡萄酒品质。
非酿酒酵母具有优良的酿造特性，如高产香气化合物（酯类、苯乙醇等）、高产增香酶类（酯酶、β-糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶等）、释放更多的甘露糖蛋白、低产乙酸来改善葡萄酒的风味、口感和颜色。
1.1 香气
葡萄酒有三类香气，其中的一类香气是来源于葡萄果实的品种香，赋予了葡萄酒清新的果香花香。混合发酵有助于本类香气的释放。葡萄糖苷酶水解非挥发性的萜烯-葡萄糖苷的糖苷键，释放挥发性的萜烯类物质（香叶醇、里那醇、橙花醇等），增强了葡萄酒的果香与花香，尤其是热带水果香气。发酵过程中的葡萄糖苷酶大部分由非酿酒酵母分泌。
含硫化合物在葡萄酒中一般表现出不良风味，然而某些痕量级挥发性硫醇表现出愉悦的香气。挥发性硫醇如4甲基-4-巯基-2-戊酮（4MMP）等赋予了‘长相思’葡萄酒的典型香气（灯笼椒、黑醋栗、柑橘皮）。酵母菌的代谢使得挥发性硫醇从和半胱氨酸结合的前体物中释放出来。混合发酵的菌种相互作用也可以提高葡萄酒挥发性硫醇的含量。Renault等发现酿酒酵母和戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）在混合发酵过程中协同作用使得3-巯基己醇含量提高，表现出水果香气，然而在葡萄酒陈酿过程中3-巯基己醇带来的水果香气会减少进而转化为香薄荷、鸡肉和咖啡气味。Nicole等人用酿酒酵母和克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）按 1:9 的比例混合发酵可提高‘长相思’葡萄酒中3-巯基己基乙酸盐的浓度。
由酒精发酵产生的挥发性风味物质形成的发酵香是葡萄酒中最主要的香气。形成发酵香的风味物质主要是乙醇、高级醇、杂醇和酯类。杂醇油和高级醇在酵母细胞中由氨基酸在欧利希通路（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸）分解代谢得到。例如，苯丙氨酸代谢可以得到苯乙醇和乙酸苯酯，这两种物质都带有玫瑰香气。缬氨酸代谢产生异丁醇，亮氨酸代谢产生异戊醇，异亮氨酸代谢产生2-甲基丁醇。Amparo等在研究不同酵母菌发酵香气特征时发现，非酿酒酵母中的季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii），Wickerhamomyces subpelliculosus, Starmera caribaea, Hanseniaspora vineae, Kazachstania gamospora 和Torulaspora microellipsoides产生上述三种杂醇的量是酿酒酵母的3～27倍，说明在非酿酒酵母细胞中欧利希通路支链氨基酸表达量更高。另外有研究显示，即使发酵环境相似，不同种酵母菌产生的高级醇种类和产量存在差异，说明非酿酒酵母调节欧利希通路的机制比酿酒酵母更多样。
大量研究表明，非酿酒酵母的产酯能力高于酿酒酵母。非酿酒酵母高产脂肪酶，酒香酵母（Brettanomyces）、酿酒酵母和德巴利汉生酵母（Dabaryomyces hansenii）都有酯酶活性。脂肪酶降解来自葡萄和酵母菌自溶的脂质释放脂肪酸形成酯类。唐凤仙等利用新疆地区自选产香酵母S1和产酒酵母T1菌株混合发酵‘红提’葡萄发现，葡萄酒的总体香气成分提高，酯类物质相对含量提高了48%；醇类物质总体下降，但苯乙醇、正己醇等高级醇含量有所提高[19]。
对葡萄酒香气有贡献的酯类是高级醇的乙酸酯和中链脂肪酸乙酯。通常认为酿酒酵母发酵高产乙酸酯，如乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯。在Amparo的同一研究中发现，Starmera caribaea和Hanseniaspora guilliermondi 酵母菌产上述乙酸酯的量比酿酒酵母Lalvin T73高44～84倍。乙酸酯赋予葡萄酒香蕉、梨和热带水果的香气。酿酒酵母高产己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯三种酯类，酿酒酵母其他四种酵母（Galactomyces geotrichum，Saccharomycopsis vini，Kregervanrija fluxuum和Rhodosporidium kratochvilovae）的丁酸乙酯和异戊酸乙酯产量很高，这五种酯类使得葡萄酒带有水果（菠萝、苹果）香气。
葡萄酒在陈酿过程中会发生酵母菌的自溶，这时，酵母细胞中的代谢物质和酶被释放出来，酶将细胞蛋白、核酸和脂类分解成氨基酸、肽、脂肪酸和核苷酸，这些物质是合成杂醇油、高级醇和酯类的前体物质。混合发酵条件下酯酶、脂肪酶、蛋白酶大量存在，因此使得香气物质更加丰富。葡萄酒的香气强度、复杂度和协调性得到提升和改善。
在菌种香气复杂度方面，有些酵母菌种产生的香气成分更复杂多样，而有些酵母菌种则显示出香气物质的同质性。这取决于种内变异发生的位置是否影响代谢产生风味物质的通路，而不是种间遗传距离的远近。例如，Starmera caribaea 酵母菌种的扩增片段长度多态性信息有差异但显示出香气物质的同质性，而Hanseniaspora guilliermondii和Kazachstania zonata两株酵母菌显示出不同的香气特征，但是扩增片段长度多态性信息差异小于5%。这说明种内变异刚好影响了香气物质代谢通路。这样的菌株是研究基因变异调节某一特定香气物质的理想对象。
非酿酒酵母产甘露糖蛋白能力优于酵母菌，混合发酵体系甘露糖蛋白水平更高，对葡萄酒香气具有积极作用。甘露糖蛋白是位于酵母细胞外壁上的一类糖蛋白，其通过对葡萄酒中挥发性物质结合作用，避免香气成分的散失而增强葡萄酒香气的持久度[21]。葡萄酒中的甘露糖蛋白有两种来源，一是由酵母菌在酒精发酵过程中分泌（0.1~0.15 g/L）；二是陈酿过程中酵母自溶，细胞壁结构破坏，甘露糖蛋白和细胞壁中的葡聚糖、几丁质分离。Pascale等利用提取的甘露糖蛋白在模拟酒液中采用指数稀释（动态）和静态顶空分析技术检测乙酸异戊酯、己醇、乙酸乙酯和β-紫罗兰酮的挥发性发现，甘露糖蛋白可与这四种香气物质发生结合，使其挥发性降低，产生保留作用，甘露糖蛋白浓度为0.15 g/L。Juega发现高浓度的甘露糖蛋白对萜烯（香叶醇和芳樟醇）也有保留作用。Domizio等研究发现非酿酒酵母嗜高渗汉逊酵母（Hanseniaspora osmophila）、耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、路德氏酵母（Saccharomycodes ludwigii）和戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）在无多糖葡萄汁中释放甘露糖蛋白的能力高于酿酒酵母[25]。除此之外，Laura等人发现酿酒酵母和克鲁维酵母菌的天然杂种的发酵环境中甘露糖蛋白的含量高于酿酒酵母发酵，作者还发现天然杂种内基因组相互作用创造了促进甘露糖蛋白分泌的生物环境。
混合发酵影响葡萄酒香气不仅由于非酿酒酵母的代谢活动，并且与非酿酒酵母和酿酒酵母之间的相互作用有关。有研究发现，戴尔凯氏有孢圆酵母和酿酒酵母混合发酵体系中乙酸异丁酯和乙酸异戊酯产量显著高于两种酵母单独发酵，乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯和癸酸乙酯产量和酿酒酵母的最大菌数在同时接种发酵条件下显著高于顺序接种，这说明这两种物质产量的提高是酿酒酵母对于戴尔凯氏有孢圆酵母存在于发酵体系中做出反应的结果[27]。Moreira 等比较了葡萄汁有孢汉逊酵母的纯种和混合发酵，与纯种发酵相比，混合发酵中酯产量增加而乙酸乙酯产量降低。通过使用具有低水平乙酸乙酯的异常毕赤酵母 (Pichia anomala) 突变体与野生型对比研究发现，异常毕赤酵母发酵产生的乙酸乙酯是导致酿酒酵母乙酸酯水解酯酶活性的增加的原因，同时检测到混合发酵体系中乙酸乙酯含量的降低和乙酸异戊酯含量的升高。可能的原因是乙酸酯水解酯酶分解乙酸乙酯释放乙酸，乙酸与发酵产物异戊醇发生酯化反应生成乙酸异戊酯，因此尽管在乙酸酯水解酯酶活性高于纯种发酵的条件下，混合发酵依然增加了乙酸异戊醇含量使香气更加丰富。
1.2 口感
在品尝葡萄酒时，酸度、甜味、单宁、乙醇构成葡萄酒的基本味觉，苹果酸酒石酸等有机酸形成酸味；糖、乙醇和甘油具有甜味；单宁产生收敛感；乙醇有温热、轻微灼烧的感觉。酸度、酒精度、单宁（红葡萄酒）和甜味组合形成的结构一般被认为是支撑起葡萄酒的酒体。
1.2.1 甘油
甘油浓度超过5.2 g/L会产生甜味，甘油还可以增加葡萄酒黏稠度，赋予葡萄酒柔和圆润的口感和饱满的酒体。酿酒酵母产甘油量一般在5~8 g/L。许多非酿酒酵母都有比酿酒酵母更优越的产甘油能力，如非酿酒酵母星形假丝酵母（Candida stellata）产甘油能力非常突出，最高可达到14 g/L。有趣的是，这种非酿酒酵母通常只能代谢果糖，葡萄酒中的糖分是果糖的残留，因而与酿酒酵母混合发酵，在发酵完成时可使残糖含量大大降低，还能缩短发酵时间。许多产区干红葡萄酒都存在残糖高（5~10 g/L）的问题。利用这种非酿酒酵母混合发酵是一种可能的解决方法。但是需要注意，甘油会打破酵母细胞内氧化还原电位的平衡，乙酸、乙醛和乙偶姻增加导致葡萄酒风味不良[33]。
1.2.2多糖
多糖能够增加葡萄酒的黏性和酒体的饱满度，柔化涩感。葡萄酒中含量最丰富的多糖是来源于葡萄的阿拉伯半乳糖蛋白，其次是甘露糖蛋白。研究发现，发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、嗜高渗汉逊酵母（Hanseniaspora osmophila）、路德氏酵母（Saccharomycodes ludwigii）、贝利接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）与酿酒酵母混合发酵后葡萄酒中多糖的浓度增加。
1.2.3 有机酸
混合发酵可以实现生物降酸。葡萄醪中过量的有机酸不仅影响酵母发酵，而且得到的葡萄酒酸/甜、风味/香气味感不平衡。酒石酸和苹果酸占葡萄果实有机酸含量的90%，比例大约在1：1到1：3，在正常红葡萄酒pH（3.4）下酒石酸酸味强度是苹果酸的三倍。苹果酸呈现尖锐的青苹果酸味，酒石酸带有柠檬酸味且不会被乳酸菌和酵母菌分解。此外，乙酸是葡萄醪和葡萄酒中最主要的挥发酸，其酸味柔和，是酒精发酵和乳酸菌代谢的副产物，葡萄酒中乙酸含量超过0.8～0.9 g/L就会显示出明显的醋味，果香丧失，酒体单薄。因此，维持乙酸正常水平同时使苹果酸降解转化是葡萄酒降酸的目标。
苹果酸-乳酸发酵是降低苹果酸的常用方法。酿酒酵母在酒精发酵过程一般不会分解代谢苹果酸，而有研究发现裂殖酵母属菌种在酒精发酵过程中可以有效代谢苹果酸。耐热克鲁维酵母被报道有降低葡萄酒乙酸含量的效果。Ángel等人发现利用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和耐热克鲁维酵母连续接种发酵和粟酒裂殖酵母单独发酵的葡萄汁中苹果酸几乎完全被消耗，粟酒裂殖酵母利用苹果酸产生乙醇和二氧化碳，耐热克鲁维酵母发酵产生乳酸，柔化尖锐的酸味，并且葡萄酒果香更浓郁，乙酸保持在正常范围内，无需进行苹果酸-乳酸发酵。生物胺含量降低至2 mg/L。混合发酵降酸效果显著并节约了二次发酵的时间，降低了细菌性腐败的风险。
克鲁维耐热酵母具有代谢产生乳酸的能力，与酿酒酵母混合发酵可以提高葡萄酒酸度。采用低酸葡萄汁混合发酵后葡萄酒pH由4降低到3.5，这对气候炎热，葡萄酸度不足地区的葡萄酒生产具有积极作用[46]。
1.2.4 乙醇
目前，降低乙醇含量成为葡萄酒研究的方向。一是由于气候变暖导致葡萄果实成熟度高糖含量高，发酵后乙醇含量升高，许多地区葡萄酒酒精度常常超过15% (v/v)。高糖会引起微生物生长抑制或裂解，推迟酒精发酵。酒精发酵副产物甘油和乙酸增加，乙酸可能引起不良风味，较高pH值（4左右）会导致葡萄汁和葡萄酒微生物稳定性降低，增加酒体变质和感官品质退化的可能性。高乙醇含量增强了葡萄酒的灼热感和酒体，降低了对其甜味、酸味的感知，不利于香气复杂度的表现；二是由于消费市场和观念的变化，消费群体年轻化多样化使得葡萄酒种类越来越多，低醇就是一种新的发展趋势。
发生在酵母细胞内的糖酵解过程是一个由NAD+/NADH平衡控制的氧化还原反应体系。一般情况下，大部分的NAD+在3-磷酸甘油醛脱氢过程中被消耗，因此，NADH的大量存在使得糖酵解反应体系还原性非常强。而乙醛被还原生成乙醇的反应消耗了NADH，使得氧化还原电位平衡。因此通过改变NAD+/NADH平衡（消耗NADH）来重新定向反应终点是生物降醇的一种思路。新的反应终点可以是糖酵解中的甘油或风味物质代谢中的风味物质。例如，用耐热克鲁维酵母和酿酒酵母连续接种混合发酵在降低乙醇的同时发现甘油和丙酮酸含量的升高。改变氧化还原电位的方法有：添加代谢物、升温和利用具有特定代谢特征的酵母菌。代谢物有糠醛、香草醛、有机酸（肉桂酸、苯甲酸、甲酸、丙酸）、氯化钾、氯化钠、二氧化硫和碳酸钠，但是添加代谢物和升温都不可避免影响葡萄酒的香气特征。
Contreras等对50种不同非酿酒酵母和酿酒酵母分别连续接种混合发酵的降醇能力进行了评估，结果发现，非酿酒酵母Metschnikowia pulcherrima AWRI1149降醇效果最好，分别使‘夏敦埃’和‘西拉’葡萄酒的酒精度下降了0.9%和1.6%[56]。一些菌种如葡萄汁有孢汉逊酵母、葡萄汁接合酵母（Zygosaccharomyces sapae）、贝利接合酵母和双孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）在纯种发酵‘Verdicchio’和‘Trebbiano’葡萄时具有低产乙醇的潜力。 仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae ）和葡萄汁有孢汉逊酵母可用于生产低酒精度的‘长相思’和‘比诺塔吉’葡萄酒。杆状假丝酵母（Starmerella bacillaris）和酿酒酵母连续接种混合发酵在工业生产试验中使‘巴贝拉’葡萄酒酒精度下降 0.7% (v/v)[58]。
混合发酵还可以弥补目前生产低醇葡萄酒普遍采用的减少可发酵糖分、蒸馏脱醇以及添加 SO2终止发酵造成的香气成分损失。
1.3 颜色
红葡萄酒中主要的呈色化合物是花色苷[60]。但花色苷结构易受发酵、陈酿和贮藏过程中环境因素（温度、光照、氧气、pH值、游离二氧化硫）影响而破坏。因此，提高葡萄酒中总花色苷或稳态花色苷（vitisins、吡喃花色苷）含量，避免稳定的花色苷衍生物破坏是改善葡萄酒颜色和护色的目标。
首先，非酿酒酵母产生的果胶酶有利于花色苷在浸渍阶段从葡萄皮中浸出进入发酵液，提高发酵液中花色苷含量，改善红葡萄酒颜色，有助于澄清和过滤过程的进行。假丝酵母、隐球酵母、克鲁维酵母和红酵母都可以产生果胶酶。其次，酵母菌能够通过改变颜色的强度和色调直接或间接地影响葡萄酒颜色，主要通过以下两种方式：第一，增加花色苷修饰物乙烯基苯酚、乙醛和丙酮酸和羟基肉桂酸等物质的产量形成更多的稳态葡萄酒色素。第二，通过有机酸代谢改变pH，低pH增强花色苷的呈色性。耐热克鲁维酵母可代谢产乳酸，具有降低pH护色的作用。丙酮酸和乙醛与二甲花翠素-3-O-葡萄糖分别相互作用生成vitisin A和vitisin B。这种花色苷衍生物抗氧化活性强，陈酿过程中不易分解，对SO2和pH变化稳定性强。vitisins呈橙红色调，使酒体色泽呈现砖红色。研究表明混合发酵能够有效促进丙酮酸和乙醛量的增加[69]，从而使vitisins的含量增加，起到改善葡萄酒颜色的作用。研究发现粟酒裂殖酵母和耐热克鲁维酵母连续接种发酵比酿酒酵母发酵含有更多vitisins A。另外，羟基肉桂酸脱羧酶能促进乙烯基苯酚类吡喃花色苷的形成，季也蒙毕赤酵母具有较高该酶活性。Morata 等研究发现裂殖酵母具有较高的产丙酮酸能力和羟基肉桂酸脱羧酶活性[73]。
此外，甘露糖蛋白显示出对葡萄酒颜色的有益影响。这种大分子胶体通过空间位阻稳定作用，减少其他单宁和色素分子聚集沉淀，降低花青素的降解速率，增强葡萄酒颜色稳定性。Valerie 等利用从葡萄酒中提取到的六种多糖物质，研究其对单宁聚集的影响，发现只有甘露糖蛋白能显著地减小单宁聚合成形成的胶体颗粒的大小，防止其发生沉淀。Alcalde 等通过对葡萄酒色素成分分析发现，添加甘露糖蛋白能减少冷处理后葡萄酒中的花色苷衍生物（黄烷醇-花色苷复合物、vitisin A）的损失。表1列出了一些非酿酒酵母对葡萄酒酿酒质量参数的改善作用，其中几种非酿酒酵母已有商业化生产。
2 混合发酵动力学和发酵条件探索
混合发酵动力学是研究在同一发酵环境中多菌种的动态发酵活动。通过监测不同酵母菌数量、酒精体积分数、还原糖等指标，建立动力学模型。优良非酿酒酵母菌种在实际应用时是否能顺利完成酒精发酵并达到预期的改善葡萄酒品质的要求，需要混合发酵动力学指标来评估。除此之外，混合发酵过程条件选择和优化（接种方式、比例等）同样需要在充分了解不同酵母菌代谢活动过程后进行。
2.1混合发酵动力学
葡萄酒酒精发酵期间酵母菌生长遵循“S”形曲线，单一酿酒酵母发酵在第3～5天进入生长稳定期，细胞数可以达到108 CFU/mL左右。在非酿酒酵母和酿酒酵母同时接种的混合发酵情况下，两种酵母存在明显的竞争关系。酿酒酵母和非酿酒酵母的细胞数均低于纯培养条件下的细胞数。酵母的总生长量一致或高于酿酒酵母纯发酵的总菌数的情况都有出现。当非酿酒酵母与酿酒酵母数量相近时，非酿酒酵母对酿酒酵母的影响不大。王星晨等1：1同时接种酿酒酵母和有孢汉逊酵母发酵‘爱格丽’葡萄汁，发现酿酒酵母的生长曲线与纯发酵接近，非酿酒酵母对酿酒酵母生长几乎没有影响，而李婷等研究发现，毕赤酵母与酿酒酵母1：1 接种混合发酵中的酿酒酵母数量低于酿酒酵母纯发酵时的菌体数量。随着非酿酒酵母比例提高，其对酿酒酵母的影响愈发显著。表现为酿酒酵母达到稳定期时间推迟且细胞数水平降低。有研究发现，非酿酒酵母与酿酒酵母接种比例为4：1、10：1的发酵体系中，非酿酒酵母明显抑制了酿酒酵母的生长，使酿酒酵母达到最大菌数的时间推迟了24 h以上，最大菌数（0.9 × 108 CFU/mL）也明显低于酿酒酵母纯发酵体系中的酵母数量（1.43 × 108 CFU/mL）。Viana等发现混合发酵降低了发酵前期葡萄糖消耗速率，并且和非酿酒酵母接种比例成反比，嗜高渗汉逊酵母和酿酒酵母接种比例为75：25和90：10分别使葡萄糖消耗速率下降了10%~20%和20%~30%。虽然酿酒酵母的生长会受到非酿酒酵母的抑制，但并不改变酿酒酵母在葡萄汁中的生长优势。非酿酒酵母通常存在于发酵的初期阶段，酿酒酵母随后会占据主导地位，控制酒精发酵进程，非酿酒酵母会完全消失。
酿酒酵母和非酿酒酵母同时接种发酵往往会导致非酿酒酵母的消亡。一般认为是由于糖和其他营养物质的消耗，乙醇产生和氧气的缺乏。这种菌种之间的拮抗作用机制可以描述为：（1）杀伤因子，由酿酒酵母非染色体基因编码的多肽类物质。事实上，相似的多肽类物质以及杀伤现象在酵母菌中广泛存在。例如戴尔凯氏有孢圆酵母种，以及众多酵母属如毕赤酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、隐球酵母、德巴利氏酵母、汉逊酵母、梅奇酵母、球拟酵母属、黑粉菌属、威力士南属和接合酵母。（2）酿酒酵母在酒精发酵时分泌的抗菌肽对和葡萄酒相关的酵母菌（如布鲁塞尔德克酵母）和细菌（酒球菌）有抑制作用，这些抗菌肽与酿酒酵母中的3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白片段有一致性。除此之外，酵母菌之间细胞接触机制也被认为是引起非酿酒酵母死亡的原因。
Comitini等研究发现，非酿酒酵母对于酵母菌生长动力学的影响可能与它的细胞浓度和存活的时间有关系。因此，提前接种非酿酒酵母进行连续混合发酵是另一种接种策略。提前接种有利于非酿酒酵母的生长繁殖和生存。王星晨在上述同一研究中发现葡萄汁有孢汉逊酵母在同时接种处理中第8天消失，但是在提前接种处理的发酵过程中表现出最高的细胞浓度以及后期较低的衰减速率和较少的衰减数量。Yamaoka等在酿酒酵母与乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）的混合发酵过程中，发现后者代谢产生的甘油、丙氨酸等物质可以改变酿酒酵母细胞内氨基酸水平，延长其细胞生命周期[108]。有研究发现提前接种非酿酒酵母的混合发酵稳定期酵母数量均超过单一酵母纯发酵，提前96 h接种处理酵母数量最高，可达7.9 × 107 CFU/mL。
2.2混合发酵接种方式
连续接种发酵使非酿酒酵母在发酵前期有更高的代谢表达量，理论上有利于非酿酒酵母与香气代谢有关的酶类的积累，适合生产香气浓郁复杂的葡萄酒。同时接种混合发酵限制了非酿酒酵母的生长，降低了与非酿酒酵母代谢直接相关的代谢产物。例如，Renault等对比分析了连续接种和同时接种发酵葡萄酒中的酯类物质发现，丙酸乙酯,、异丁酸乙酯和二氢肉桂酸乙酯水平与非酿酒酵母戴尔凯氏有孢圆酵母的生长状况（最大菌数水平）直接相关，被视为非酿酒酵母的活动标记物，因此与连续发酵相比，同时接种发酵降低了这类物质的产生。然而同时接种增强了非酿酒酵母和酿酒酵母之间的相互作用，这种相互作用可能会引发酶类和挥发性物质的产量提升。在同一研究中，同时接种发酵产生了更多的乙酸异丁酯和乙酸异戊酯，赋予葡萄酒水果香气。李婷等发现同时接种比提前接种的发酵体系中有更高的酯酶活性积累量。在实际生产中，酿酒师会根据葡萄酒的风格特点选择合适的非酿酒酵母以及接种方式。
2.3混合发酵接种比例
混合发酵不同接种比例不会影响酒精发酵的正常完成。接种比例通过改变非酿酒酵母的存活数量和存活时间影响非酿酒酵母和酿酒酵母代谢产物的比例，进而对葡萄酒风味特征产生作用。Lee等发现接种比例是混合发酵调节木瓜酒风味的重要因素，土星拟威尔酵母（Williopsis saturnus）与酿酒酵母10：1接种非酿酒酵母增加了木瓜酒中乙酸酯的含量，而1：1和1：10的接种比例使木瓜酒中的乙醇酯、高级醇和2-乙酸苯乙酯含量增加。王倩倩等利用毕赤酵母与酿酒酵母酿造‘爱格丽’干白葡萄酒，发现较高比例同时接种毕赤酵母（毕赤酵母和酿酒酵母接种比例为1：1、4：1、10：1）更能促进酒中乙酸酯、乙醇酯、异戊醇与苯乙醇的生成，尤其是中链脂肪酸及其酯，高比例不同处理之间葡萄酒又呈现出不同的风格，毕赤酵母和酿酒酵母4：1接种赋予葡萄酒较强的花香特征，毕赤酵母和酿酒酵母1：1接种使得所酿酒表现出较强的柑橘类香气。
3 多菌种互作机制
混合发酵过程存在微生物相互作用。许多研究已经表明，非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵与单菌株发酵之间代谢活动存在很大差异。混合发酵中存在或缺失不同于纯种发酵的菌株特异性组分。这说明混合发酵不是纯种发酵加和的结果，而存在不同菌种（株）之间相互作用。在‘长相思’葡萄汁中混合培养光滑念珠菌和毕赤酵母，经过65代繁殖，混合发酵条件下的菌株相比于纯种发酵已经显示出可遗传的生长代谢差异，葡萄酒风味物质和香气成分种类更为复杂多样。这种微生物相互作用被称为共同进化，共同进化对于优化酵母菌的发酵特性具有一定意义。
微生物相互作用主要有两种方式。一方面，环境和遗传物质的变化导致微生物代谢物变化，从而影响了其他微生物的基因表达和酶活性变化进而引起代谢反应和生长反应，这种相互作用可以表现为：养分（氧、维生素、氮源）的竞争；具有拮抗作用的物质（乙醇、中链脂肪酸、杀伤因子和抗菌肽）的分泌引起其他微生物代谢水平降低或死亡；代谢物（乙醛、乙偶姻、葡萄糖、果糖等）的补充消耗或交换，表现出协同效应。例如，酵母菌中存在的群体感应现象是由于群体感应活性分子使酵母形态从丝状转变到菌丝体或酵母菌形态。蛋白质代谢物（抗菌肽、致死蛋白）的产生对混合共发酵中酵母菌种的生长和优势地位的确立有着显著的影响。非酿酒酵母具有比酿酒酵母具有更广谱的抗菌能力，可以利用这一特点对葡萄汁中有孢汉逊酵母及酒香酵母、德克酵母等破坏性酵母增殖进行控制，提高葡萄酒微生物稳定性。另一方面，细胞膜（壁）成分介导的或代谢物介导的细胞直接接触共聚合，这种相互作用可能提高微生物的生存能力也可能诱导细胞死亡。例如，酿酒酵母在酸性条件下可以和鼠李糖乳杆菌可能通过细胞直接接触共聚合提高鼠李糖乳杆菌菌株的浓度。利用死酿酒酵母细胞和酿酒酵母发酵上清液进行实验都发生相同的结果。而在酿酒酵母与戴尔凯氏有孢圆酵母混合发酵过程中，酿酒酵母通过直接的物理接触或非常接近的方式诱导了戴尔凯氏有孢圆酵母的细胞死亡。因此，在代谢组层面研究微生物互作机制是基础且重要的一步。
葡萄酒成分和菌种互作的复杂性对分析技术和实验设计提出了更高的要求。利用高分辨率分析技术，如超高分辨率质谱，可以鉴别出发酵液中混合发酵特异性产物，特异性产物的存在或缺失以及参与相互作用化合物含量变化都可以作为判断菌种（株）和其生理代谢过程特异性的依据。完善的代谢组数据库有助于了解某一菌种（株）在其它菌种（株）存在的条件下代谢物的变化。混合发酵的微生物变量是菌种数量和酵母菌种类。因此，以代谢组学为基础研究混合发酵微生物互作机制首先探究清楚两种微生物一对一的相互作用过程，用代谢组学信息阐明相互作用过程。然后依次增加酵母菌数量，建立混合发酵代谢组数据库，建立相互作用关系模型。结合混合发酵动力学的研究，多菌种互作机制可以为建立发酵模型提供数据基础。同时，利用代谢产物的研究成果，定性定量分析不同菌种（株）在混合发酵过程中代谢产物的差异，有助于更准确地判断葡萄酒化学组成、控制发酵进程。
近年来，组学技术成为研究微生物相互作用机制的重要手段。基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学分别从DNA、RNA、蛋白质和代谢物水平揭示微生物在生命过程中的一系列变化，有助于从根本上认识微生物间复杂的相互作用机制。例如，转录组学和生理代谢结合可以了解酵母菌在混合发酵体系中对环境变化的反应。然而，目前葡萄酒多菌种互作研究多处于代谢组学层面。在基因组和转录组学层面，混合发酵条件下酵母菌的代谢物、种群结构、动力学和发酵能力和单一菌株对营养环境反应尚未研究清楚。
4 展望
首先，混合发酵涉及到种类众多的非酿酒酵母，这些非酿酒酵母往往来源于自然环境，目前国内外分离到许多优良非酿酒酵母，然而非酿酒酵母的分离鉴定、选育到实际应用面临许多困难。非酿酒酵母对环境的耐受性差，因此制成的商业化发酵剂的发酵效果难以保证。需要在筛选非酿酒酵母时选择耐受性强且发酵特性良好的菌种。非酿酒酵母的筛选还要考虑到其在混合发酵条件下的香气特征。
其次，目前研究的混合发酵通常是一种非酿酒酵母和一种酿酒酵母，而当参与的菌种数量变得更多的情况下，酵母菌的代谢活动、相互作用和混合发酵动力学会发生怎样的变化还未研究清楚。如何根据葡萄品种、风土和预期葡萄酒风格搭配使用不同酵母菌来发挥葡萄最大的酿造潜力是未来混合发酵的一个研究方向。葡萄酒的不同风格可以通过搭配不同的非酿酒酵母来控制香气物质的含量来实现，比如果香型葡萄酒的游离萜烯类物质、酯类物质含量高，陈酿型葡萄酒的高级醇和中链脂肪酸含量高。
另外，为了实现混合发酵的实际应用，混合发酵条件的控制需要更加具体，精细到酿造工艺环节的条件控制，还要考虑到营养环境变化对混合发酵效果的影响，比如碳源、氮源、微量成分、氧气和温度等，此外，进行大规模混合发酵葡萄酒生产的试验也是十分有必要的。
最后，在基因组和转录组学层面研究酵母菌种群结构、非酿酒酵母酿造特性、多菌种相互作用机制是从根本上认识和调控混合发酵葡萄酒品质的基础，目前逐渐成为研究热点。