石家庄综合试验站
摘要：根据本研究室前期测序的QTL定位数据，筛选了1个响应霜霉菌侵染的抗病基因ABC转运蛋白（ABCF4）。从夏黑葡萄叶片中扩增得到了该基因的全长片段。结果显示：该基因的ORF为2396bp，编码731个氨基酸，分子量为81356.77，理论等电点(pI)为5.75。该蛋白含2个核苷酸结合结构域（NBD），为典型ABC转运蛋白F亚家族；该蛋白稳定性较好，为亲水性蛋白，二级结构以α-螺旋（43.91%）与不规则卷曲（36.39%）为主要结构原件，还有少量延伸链（14.36%）与β-折叠（5.34%）结构。将ABCF4氨基酸序列与其他物种进行对比，并构建系统进化树发现，其与黄瓜（葫芦科）的进化关系较近，与十字花科、兰科的进化关系较远。通过实时荧光定量分析在葡萄不同组织中的表达，结果显示在根、芽中表达量较高，其余组织表达量较低。构建了亚细胞定位载体，瞬时侵染本氏烟，通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布情况，发现该基因定位在细胞膜，为进一步葡萄ABCF4基因的功能奠定了理论基础。
关键字：葡萄；ABC转运蛋白；克隆；亚细胞定位
ABC转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)，是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一，普遍存在于原核生物和真核生物中。ABC大部分成员均能利用ATP水解产生的能量直接将底物逆浓度梯度进行跨膜运输，转运底物包括其中包括肽、糖、脂、重金属螯合物、多糖、生物碱、类固醇、无机离子和谷胱苷肽结合物等多种化合物。自从1992年报道了第一个植物ABC转运蛋白，即拟南芥中克隆的AtPGP1，大量研究表明ABC转运蛋白在植物激素的极性转运、解毒、植物抗病、抗重金属离子、脂质降解和气孔调节等诸多生理活动中发挥作用，是植物器官生长，营养物质运输，响应胁迫等过程中至关重要的转运蛋白。Peter Amoako Ofori研究发现SIABCB4能特异转运3-吲哚乙酸，在果实发育初期有较高的表达，认为SIABCB4能促进生长素在番茄果实中的分布，调控番茄果实的发育。吕换男等通过研究‘鸭梨’及其自交亲和性芽变品种‘金坠梨’花粉的差异表达蛋白，发现了6个显著下调的ABC转运蛋白，认为ABC转运蛋白的显著下调可能影响了‘金坠梨’花柱S-RNase 进入‘自己’花粉管的运输过程而导致其亲和性突变。张瑞杰等通过分析了干旱处理下谷子叶片的转录组测序，筛选出4个与抗旱相关的ABC转运蛋白差异基因，并进一步验证干旱处理下其表达情况，推测Seita.7G176000.1基因可能为谷子抗旱候选基因，参与谷子抗旱调控。
ABC转运蛋白主要分为A-H8个主要的亚科，不同于其它亚家族，ABCF（GCN）转运蛋白的特征是不含跨膜结构域（TMD），仅含2个核苷酸结合结构域（NBD），没有参与转运，而是参与DNA修复、基因表达的转录和调控等细胞过程。已有报道显示，植物ABCF亚家族蛋白在抗生物胁迫与非生物胁迫过程中扮演重要角色，但相对应的功能研究仍是初步认识，并未深入阐明。李绍华等克隆了一个岷江百合ABC转运蛋白LrABCF1基因，过表达矮牵牛植株显著降低了转基因植株正常生长发育速度，增强了矮牵牛转基因植株对CMV、TRV和B.cinerea侵染的抗性，研究结果表明，LrABCF1提高了PhGCN2和一些在SA信号通路中防御相关基因PhPR1和PhPR2的转录水平，在百合抗病毒和抗真菌侵染上扮演着重要角色。于冰娜等鉴定了一个马铃薯ABC转运蛋白NbGCN4，过表达NbGCN4烟草植株对晚疫病的抗性降低，然而沉默NbGCN4后烟草对晚疫病的抗性提高，结果表明NbGCN4基因对晚疫病菌抗性可能是负调控的作用。可见，ABCF亚家族在植物抗病方面发挥着重要作用。
本研究基于已经报道的葡萄ABC转运蛋白数据和本研究室前期测序的QTL定位数据，确定了1个响应霜霉菌侵染的抗病基因ABC转运蛋白（ABCF4），克隆并探讨其功能，为葡萄霜霉病的抗性研究奠定基础，为解析葡萄与真菌互作机制研究提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1材料
试验于2020年在石家庄果树研究所进行。葡萄植株选取选取5年生夏黑为试材，南北行向，高干T型架，株行距2m×8m，行间自然生草，田间肥水与病虫害防治按照葡萄园常规管理措施进行管理。取根、茎、叶、花、果实样品，自封袋保存，液氮速冻后-80℃保存备用。
将本氏烟草种子用75%的酒精浸泡20min，用无菌水冲洗3-5次，点播于育苗基质内并覆膜保湿，出芽后撤去覆膜，在人工气候室25℃恒温培养。
菌株、试剂、质粒
霜霉菌于田间采集培养；克隆T载体、感受态大肠杆菌菌株DH5α与农杆菌GV3101、抗生素等购自生工生物工程上海股份有限公司；限制性内切酶SalI、XhoI及反转录酶购自赛默飞世尔科技公司；重组试剂购自诺唯赞生物科技股份有限公司；PBI121-EGFP载体为本实验室保存。
1.2方法
1.2.1总RNA提取与cDNA合成
以‘夏黑’叶片为试材，利用植物总RNA提取纯化试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）提取叶片的总RNA。用1.0%凝胶电泳检测RNA质量。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Thermo scientific公司）将提取的RNA反转录成cDNA，-20℃保存。
1.2.2 ABCF4的克隆
利用诺唯赞引物设计软件CE Desgin（http：//www.vazyme.com），输入载体序列及其目的序列（NCBI下载），直接生成扩增引物为MF:catttacgaacgatactcgagATGGGAAGGAAGAAAACAGAGGA；MR:caccatcactagtacgtcgacATCATCAACCTCTGCTTTGATCTCT。以夏黑叶片cDNA为模板，MF与MR为扩增引物，获取ABCF4基因全长cDNA（不含有终止子）。使用PrimerSTAR Max Premix（2X）试剂（TaKaRa公司）进行全长扩增。反应体系为30ul：cDNA模板5μL，上下游引物各0.5μL，Mix15μL，ddH2O 9μL。PCR程序为：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，4℃恒温保存。
PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析后，切取目标条带回收。
限制性内切酶SalI、XhoI酶切EGFP载体，酶切体系为20uL：环状质粒模板0.3ng，SalI、XhoI酶各1μL，Buffer2μL，余下ddH2O补足。37℃酶切40min，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，回收载体目的条带获得线性化载体。
重组反应：重组反应利用CloneExpressⅡOne StepCloning kit进行重组。反应体系为10uL：将线性化载体与插入片段按比例混合，摩尔比为1：2，CE Ⅱ Buffer 2uL，Exnase Ⅱ mix 1uL,ddH2O补足，37℃反应30min。将连接产物转化DH5α，挑取阳性克隆，经PCR与酶切验证后，送由生工生物工程上海股份有限公司测序。
1.2.3ABCF4的亚细胞定位
将测序正确的重组质粒纯化，利用快速冻融法将目的基因质粒导入到农杆菌GV3101中，并用菌液PCR方法鉴定阳性克隆。挑取阳性克隆置于含有 Kan/Rif（各50mg/mL）的液体 LB 培养基中，并培养转入空载体的农杆菌作为阳性对照，放于28℃摇床中振荡培养36 h，转速为200r/min；菌液浑浊离心收集菌体，无菌水冲洗菌体，离心后用悬浮液（内含0.1M MgCl2，0.1M MES，10mM乙酰丁香酮）重悬菌体，OD值调节为0.5-1。28℃避光静置3h后，用无菌1mL医用注射器吸取悬浮液，针头轻刺本氏烟叶片下表皮，将菌液缓缓注入叶片，24℃培养48h后观察荧光。
1.2.4 ABCF4的时空表达分析
根据测序结果利用在线设计工具Primer-BLAST设计表达引物，由生工生物工程上海股份有限公司合成。以提取1.1中材料的总RNA，反转cDNA，稀释备用。以cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂（TaKaRa公司）进行PCR扩增。qPCR 体系为：cDNA模板3.5μL，上下游引物各0.4μL，Mix10μL，ddH2O 5.7μL。qPCR程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃延伸1min，共循环40次，在65℃-95℃进行溶解曲线分析。以actin 的表达水平为内参，基因的相对表达量按BIO-RAD CFX荧光定量仪使用说明进行分析。以茎作为对照，即表达量为1，数据使用Origin 9.0软件进行处理。
2.结果与分析
2.1ABCF4克隆与生物信息学分析
以夏黑葡萄叶片cDNA为模板，扩增ABCF4的基因全长。经琼脂糖凝胶电泳分析后，发现片段长度约为2500bp左右，与预期大小相近（图1）。片段连接EGFP载体测序后通过DNAMAN软件分析发现，该基因的ORF为2396bp，AT含量为48.4%，GC含量为51.6%。进一步分析ABCF4基因编码731个氨基酸的蛋白质，该蛋白的分子式为C3556H5735N1011O1135S17，分子量为81356.77，理论等电点(pI)为5.75。该蛋白不稳定系数分别为38.15，表明其稳定性较好；总平均亲水性（GRAVY）为负值（-0.609），说明该蛋白具有亲水性，为亲水性蛋白。使用Prosite在线分析软件分析蛋白的功能结构域，结果如图2显示，仅含2个核苷酸结合结构域（NBD），为典型ABC转运蛋白F亚家族。
使用TMHMM 2.0在线软件预测对ABCF4蛋白的跨膜螺旋进行识别分析。结果显示，该蛋白不存在跨膜结构域，证明没有跨膜区域，非膜蛋白。利用SignalP在线软件对ABCF4蛋白的信号肽进行分析预测，发现不含有信号肽序列，推测该蛋白不是分泌蛋白。利用SOPMA在线软件推测蛋白二级结构，发现ABCF4蛋白的二级结构以α-螺旋（43.91%）与不规则卷曲（36.39%）为主要结构原件，还有少量延伸链（14.36%）与β-折叠（5.34%）结构。
2.2 ABCF4蛋白的系统进化
为确定葡萄ABCF4与其他植物的同源关系，利用MEGA X软件将ABCF4与NCBI上其他植物的ABCF4蛋白构建系统进化树（图3）。由图可知，遗传背景相似的植物聚为一类，比如麻风树与木薯同属大戟科；拟南芥、亚麻芥、萝卜、甘蓝同属十字花科；番茄与马铃薯同属茄科；铁皮石斛与兰花同属兰科，因此聚为一类。但木瓜与樱桃、桃同为蔷薇科植物，却并未聚到一类，出现了进化分歧。葡萄ABCF4与黄瓜（葫芦科）的进化关系较近，与十字花科、兰科的进化关系较远。
2.3 ABCF4的亚细胞定位
构建ABCF4与pBI121-EGFP的重组质粒，测序验证后转入根癌农杆菌GV3101后注射本氏烟瞬时转化，48h后激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP5II）观察叶片基因定位情况。结果如图4所示，对照EGFP蛋白的荧光信号在细胞核与细胞膜上均有分布，而ABCF4-EGFP的荧光信号集中于细胞膜上，说明定位在细胞膜。
2.4 ABCF4在葡萄不同组织中的表达
ABCF4基因在葡萄不同组织中均有表达，但表达量存在差异（图5）。其中，根、芽的表达量相对较高，分别为茎部表达量的9.22和10.21倍，而在叶、花、果中表达水平相对较低，仅为茎部表达量1.86、2.82、1.27倍。因为ABCF4在葡萄的不同组织内无需其他因子的诱导即可表达，故ABCF4在葡萄组织中属于组成型表达，且推测其可能在植物的生长发育方面同样发挥重要作用。
讨论
葡萄霜霉病是一种世界性的真菌病害，在葡萄栽培过程中极易时有发生，阴雨天气发生严重，危害着葡萄植株生长状况与果实品质。研究解析葡萄与霜霉菌互作机制具有重要的理论与实践意义。报道显示，植物ABCF亚家族蛋白在抗生物与非生物胁迫过程中扮演重要角色。王磊克隆ABC转运蛋白F亚家族基因EuABCF1，结果显示EuABCF1基因受MeJA、IAA与低温诱导表达，推测其可能在抗寒胁迫响应过程发挥显著作用。本研究基于前期测序定位的QTL数据，克隆了1个响应霜霉菌侵染的抗病基因ABC转运蛋白（ABCF4）。对氨基酸序列分析表明，ABCF4基因编码731个氨基酸，且含2个核苷酸结合结构域（NBD），为典型ABC转运蛋白F亚家族。进一步利用MEGA X软件构建ABCF4蛋白系统进化树，葡萄ABCF4与黄瓜（葫芦科）的进化关系较近，与十字花科、兰科的进化关系较远。
通过实时荧光定量qRT-PCR对葡萄ABCF4基因在茎根芽叶花果中的表达量进行检测，结果发现，ABCF4基因葡萄的不同组织中均有表达，且在芽和根中的表达量较高高，其次为花。这说明，ABCF4基因广泛参与转录调控植物组织与器官的形态建成，并且ABCF4在豆梨不同组织器官中的表达量存在差异，推测可能与在不同组织中发挥的功能有关。构建ABCF4亚细胞定位载体，并注入本氏烟中瞬时表达，本研究结果显示ABCF4定位于细胞膜，这与报道中马铃薯的GCN4与苹果的ABCF定位于细胞膜上的结果相一致。推测基因编码的产物可能在细胞膜行使其功能,参与植物的抗逆反应。
本文不足之处在于，虽然已有文献已经明确ABCF4基因在对抗生物与非生物胁迫方面发挥作用，本试验并未进行更深入的机理研究。作者已转化NC89烟草获得转基因植株，将就其在响应霜霉菌侵染过程的生物学功能做出更进一步的研究。