无核种质材料创制岗位

徐炎 张剑侠 张朝红 刘国甜 王跃进

  1　花粉采集

  在春天4~5月，根据不同品种的花期，在开花前2~3天采集花粉。花粉采集一般在晴朗天气，选择健壮的植株，健壮的树枝和健壮的花序，通常有5%左右的花开放时最好。将收集的花序放入冰盒中带回实验室，去掉复穗和花序顶端部位不成熟的花粉，用镊子或手指将花冠轻轻摘下后花粉装入折好的纸盒子里，记录好每个品种的花粉，以防花粉之间的污染。将收集的花粉放在日光灯下烘干后，用研钵将花粉磨成细粉末，然后装入10ml离心管，放在4℃冰箱备用。

  2　田间杂交

  在开花前3天选择晴朗的天气进行杂交，杂交时同样也选择健壮的植株，健壮的树枝和健壮的花序，一个结果枝中只留一穗，去掉多余的花穗，去掉复穗和顶部未散开的花朵，用镊子或手指轻轻将花冠去掉，不要伤到花柱，去雄结束后用水喷洒柱头，可清洗掉残留的花粉并保持柱头湿润，然后立即套袋，做好标记，记录去雄时间。3天后，选择早晨8~10点左右进行授粉，待柱头分泌黏液时授粉效果最佳，将提前备好的花粉进行授粉。授粉时，用用镊子夹着脱脂棉蘸花粉，将花粉抖落到去过雄的柱头上。一般连续授粉3天后可看到子房有膨大。

  3　胚离体培养过程

  根据不同无核品种胚败育时间的不同，选择最佳取样时间将杂交后的幼果放入冰盒中带回实验室进行离体胚挽救。先将取回的幼果在流水下冲洗2小时，在无菌环境下，将取回的幼果进行消毒。先将幼果放在灭过菌的广口瓶中，用75%酒精消毒30秒后用无菌水冲洗3次，再用3% NaClO（添加TWEEN 20）消毒15分钟，期间不断摇晃，最后用无菌水漂洗3次。

  在灭过菌的玻璃培养皿中将杂交幼果切开，取出胚珠，放在胚离体发育培养基中。目前，适宜葡萄胚发育的培养基有：White培养基、ER培养基、Nitsch培养基、NN培养基、MM3或MM4培养基等。MM3和MM4是适合无核葡萄与中国野生葡萄杂交后的胚生长的培养基。固-液双相培养基比固体培养基的胚发育率高，常用胚离体发育培养基主要成分为：MM3＋60g/L蔗糖＋0.2%活性炭。也可添加2.5mmol天冬酰胺或谷氨酰胺可提高杂种胚珠的成苗率。

  4　胚萌发培养过程

  在胚珠离体黑暗培养8周后在解剖镜下观察，纵剖胚珠，检查每个胚珠内胚的发育情况，同时小心取出发育杂交胚（位于胚珠的喙部，色洁白、有光泽），选择杂交胚的长度>0.5mm其萌发率最高，接种在胚萌发培养基上促进其萌发成苗。基本培养基类型主要有1/2MS、BD和WPM木本植物培养基，目前应用最多的是WPM培养基，它的主要优点是同时适用于胚的萌发和成苗。同时在胚萌发过程中常加入细胞分裂素类物质6-BA促进胚的萌发，此阶段的胚萌发培养基为WPM＋6-BA0.2mg/L＋蔗糖 20g/L＋活性炭1g/L+琼脂7g/L，每只试管接1个胚。胚的子叶、胚根有伸长的视为萌发胚。

  无核葡萄胚萌发成苗后，一般为了增加每个基因型的成活率，都会在萌发成苗后对每个杂交单株进行扩繁。选择离体条件下长势良好的胚挽救苗，在1/2×MS+0.3 mg/L IAA+ 500 mg/L水解酪蛋白的培养基上进行继代和扩繁，对诱导生根效果好，每100ml三角瓶接种1个单芽茎段，单芽茎段最好选取植株中间部位，扩繁后能得到较健壮的植株，每株可扩繁3个单芽茎段，培养40天左右，待成苗的根长大于4cm、株高大于5cm以及至少5片叶子时可得到较好的炼苗效果。

  5　杂交后代炼苗过程与移栽

  移栽炼苗一般在春季，选择生长健壮的胚挽救继代苗，以苗龄为40天左右的幼苗进行炼苗效果最佳，成活率最高。将培养瓶置于日光温室中驯化锻炼7天左右。在试管苗移栽前1-2天将封口膜解开透气以便锻炼试管苗的叶片气孔开合能力。一般使用混合基质（珍珠岩：草炭：园土=4:1:1）加水润湿后高温灭菌50min。移栽前先用流水洗去幼苗根部附着的培养基，将幼苗移栽到装有灭过菌的基质的花盆中，同时用800倍多菌灵和1/8MS营养液浇灌，加盖透明塑料杯保持湿度。移栽后3-5天后开始逐渐降低湿度，增加光强。每周交替浇灌一次1/16MS营养液和多菌灵溶液，10-15天后逐步移开塑料杯，给试管苗一个从全封闭到半封闭最后到完全开放的一个环境变化的适应过程。30天后调查移栽成活株数和壮苗（叶色浓绿、生长旺盛的植株）数量，计算温室成活率和壮苗率。

  炼苗后的第一年春天，可以先移栽到大棚圃地里，直接将基质和植株一起进行移栽，挂牌，并按照田间管理的程序管理大棚圃地的移栽苗子，并注意及时浇水和防病、虫。第二年春天再将温室圃地里的杂种苗移栽到大田进行定植。后续工作需要调查移栽苗子田间生物学性状，从而确定无核杂交后代植株。

  6　田间性状调查

  （1）抗病性调查

  于田间葡萄病害爆发期，对杂交后代的抗病性进行田间自然鉴定，每品种或株系随机选100片叶片进行统计，（不足100的，按实际叶片数统计）。葡萄抗病的分级标准如下：0级为病斑占整个叶面积0%，1级为病斑占整个叶面积0.1~5，2级为病斑占整个叶面积5.1~ 25，3级为病斑占整个叶面积25.1~ 50，4级为病斑占整个叶面积50.1 ~ 75，5级为病斑占整个叶面积75 ~ 100。

  将田间调查的以上结果根据公式换算成感病指数：

  感病指数（SI）=Σ（病级指数×该级发病叶数）/调查总叶数×最高病级值×100。

  同时，按照感病指数大小将其换算成抗性表现型。其植株表现型的划分将其划分为5级：0.0不感病（M）；0.1~5高抗（HR）；5.1~ 25抗病（R）；25.1~ 50.0感病（S）；50.1 ~ 100高感（HS）

  （2）结果植株植物学表型性

  状和葡萄经济学性状调查待杂交后代植株结果后，对其植物学表型性状进行调查主要有：

  叶片形态，花的类型，果穗的形状和大小，浆果的形状、大小和色泽，浆果的品质，如含糖量、含酸量、糖酸比、葡萄香味、芳香物质的含量以及果肉质地，种子类型。葡萄经济学性状调查内容为：植株生长势、物候期、结实力、果实中的理化性质等。根据这些综合指标，选育出新品系，为后续进行区试和生产应用提供材料。

  继续继续杂种后代的生长发育生物学特性观察，采取加快生长发育的栽培措施，促使杂种后代尽快进入结果期，进行杂种优株的筛选与培育。