病毒病防控岗位

任芳 董雅凤 张尊平 范旭东 胡国君

  葡萄卷叶病是一种世界性病毒病害， 也是我国葡萄上的主要病害，由多种葡萄卷叶伴随病毒引起， 其中葡萄卷叶伴随病毒2（Grapevine leafroll-associatedvirus-2 ，GLRaV-2）是该病害主要病原之一。GLRaV-2属于长线病毒科（Closteroviridae ）长线病毒属（Closterovirus ），常引起葡萄卷叶病，还可导致嫁接不亲和、部分品种嫁接后死亡以及幼树“速衰”等症状，给葡萄生产造成很大危害。

  GLRaV-2在我国以及美国、意大利等世界上多个国家普遍发生，分为多个变异组群，不同分离物间遗传变异性较大，给病毒检测和防控带来很大困难。病毒检测是葡萄病毒病防控的关键环节，实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）检测技术特异性强、灵敏度高，近年在果树病毒检测上得到广泛研究和应用。本实验室建立了GLRaV-2的染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术，并将其应用于田间样品及不同季节和不同部位样品的检测，结果显示该技术特异性强、灵敏度高、检测适用范围广。现将主要操作步骤总结如下，以期为GLRaV-2的高效检测提供一种可靠的技术手段，同时不同季节和部位样品的检测还可为最佳取样时间和部位的选择提供依据。

  1　材料与方法

  1.1　样品采集

  分别在春夏秋季采集葡萄植株上部（枝条顶端嫩梢从上往下第2、3 片叶）嫩叶、嫩叶柄、下部（枝条基部自下往上第2、3片叶）老叶、老叶柄、卷须和枝条等6个部位样品，冬季采集休眠枝条。

  1.2　总RNA 提取及反转录合成cDNA

  采用改良吸附柱法提取总RNA：（1）取葡萄样品约50 mg，放入塑料袋中，加入1 mL提取液研磨；匀浆转入事先加入NLS的离心管中，70℃保温10分钟，冰上放置5分钟，13000 rpm，离心15分钟；（2）取上清液600 μL，加入300μL无水乙醇，颠倒混匀45秒，混合液加入吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃掉废液；（3）加入700μL去蛋白液，室温放置2分钟，12000 rpm离心1分钟，弃掉废液；（4）加入700 μL清洗液，12000rpm离心1分钟，弃掉废液；再加入500μL清洗液，12000 rpm离心1分钟，弃掉废液；将吸附柱放回空收集管中，12000 rpm离心2分钟，弃掉废液；（5）取出吸附柱，放入新的离心管中，加50 μL DEPC水，室温放置1分钟，12000 rpm离心1分钟，所得RNA溶液–0℃超低温保存备用。

  反转录体系25.0μL：将5.0μL总RNA与1.0μL 0.1μg/μL随机引物和9.0μL水混合，95℃变性5min后立即置于冰中冷却2min；加入5.0μL 5×MLV-RT buffer、1.25μL10 mM dNTPs、0.5μL 200 U/μLM-MLV和3.25μL DEPC水，经37℃ 10 min、42℃ 50 min、70℃ 5min合成cDNA，–0℃保存备用。

  1.3　GLRaV-2 RT-qPCR技术扩增体系及反应条件

  采用GLRaV- 2 特异性引物P19qtF4/P24qtR（5’- CTAACAATTTCTTCTTTGGATCGCA-3’/5’-GAATGTCTTCAGCTTCATAAGGAG-3’）进行RT-qPCR检测，反应体系25μL，包含：2× SYBRGreenⅠqPCR Mix 12.5μL、10μM正、反向引物各0.5μL、DNase/RNase Free dH2O 10.5μL 和cDNA1μL。反应体系置于荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD CFX ConnectTMReal-Time System）上进行。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 15s，60 ℃15 s，72 ℃ 20 s，40个循环，在延伸步骤记录荧光信号。熔解曲线分析温度范围从60 ~ 95 ℃，其中每5 s 增加温度0.5 ℃，以鉴别引物二聚体和非特异性扩增。扩增程序结束，观察扩增曲线Cq 值（扩增产物荧光信号达到设定的阈值所经过的扩增循环次数）和熔解曲线，以扩增曲线Cq 值＜30且熔解曲线为单一峰判定为阳性。

  2　结果与分析

  2.1　检测特异性及灵敏度

  用建立的RT-qPCR方法检测分别感染GLRaV-2和其他9种葡萄病毒的样品，只有GLRaV-2感染样品为阳性，Cq值19.11，熔解曲线为单一峰，其余样品为阴性，表明其可特异性检测GLRaV-2。检测梯度稀释的GLRaV-2阳性样品时，常规RT-PCR最低只能检测10-1倍稀释样品，而RT-qPCR检测10-3倍稀释样品时Cq值仍小于30，为阳性，检测灵敏度可达普通RT-PCR的100倍（图1）。

  2.2　不同季节和部位样品及大量

  田间葡萄样品的检测应用利用RT-qPCR对感染GLRaV-2的6棵葡萄植株不同季节和部位共114个样品进行检测，同时采用常规RT-PCR检测进行对照。结果表明，对冬季休眠枝条样品，两种方法检测效果相当且检出率最高（均为100%），但对春夏秋季各部位样品，RT-qPCR检出率均高于常规RT-PCR。尤其是对春季样品，RTPCR检出率很低，而RT-qPCR检出率可达67%，比常规RT-PCR提高了42% 对夏季和秋季样品检出率分别比常规RT-PCR高28%和17%不同部位样品比较，RT-qPCR对老叶、老叶柄、卷须和枝条样品检出率相当（83%~88%），嫩叶检出率最低，但所有部位样品检出率均高于常规RT-PCR（图2）。综合比较各季节各部位样品检测效果，RTqPCR对夏季老叶柄、卷须、秋季枝条和冬季休眠枝条检出率最高，均达100%，其次为夏季和秋季其余部位样品及春季老叶样品，检出率均为83%。

  此外，利用RT-qPCR技术对来自我国辽宁、山东、河北等17个省38个品种的116份田间葡萄样品进行了GLRaV-2检测，同时以常规RT-PCR检测作对照。结果表明，常规RT-PCR有8个样品检测为阳性，检出率6.9%，RT-qPCR共检测到10个样品为阳性，其中包括常规RT-PCR检测为阳性的8个样品，RTqPCR检出率8.6%，略高于常规RTPCR。

  3　小结

  本研究通过引物筛选及体系优化建立了GLRaV-2的RT-qPCR检测技术，检测灵敏度可达常规RTPCR的100倍，对不同季节和不同部位葡萄样品的检测结果表明，GLRaV-2 RT-qPCR检测技术极大地提高了对不同季节或部位样品的检测效果，春夏秋季样品检出率比常规RT-PCR提高了17% ~ 42%，对不同部位的样品检出率比常规RTPCR提高了9% ~ 39%，检测适用范围更广。对来自我国辽宁、山东、河北等17个省38个品种的116个田间葡萄样品检测结果也表明，其与常规RT-PCR检测结果基本一致且检出率更高。同时，研究结果还可为选择GLRaV-2检测或脱毒的最佳取样时间或部位提供参考依据，在一定程度上提高病毒检测准确率，减少漏检情况的发生，如夏季老叶柄、卷须、秋季枝条和冬季休眠枝条检测效果最好，检出率可达100%，其次为春季老叶和夏秋季其余部位样品，嫩叶和嫩叶柄等部位样品检测效果较差，不建议作为首选检测材料。与之相反，在选择材料用于葡萄病毒脱除时，则可选择春季幼嫩组织以提高脱毒效率。