石家庄综合试验站

  无核鲜食葡萄在市场上越来越受到消费者的欢迎。无核逐渐成为育种工作者的研究热点。目前市售无核鲜食葡萄果实，大多数是有核品种经过无核化处理得到的，如玫瑰香、巨峰、藤稔、红地球等，只有小部分是天然无核品种，如夏黑无核，无核白鸡心。传统的杂交育种方式只能以有核葡萄为母本，依靠传递力强的无核父本来传递无核性状，这种方式选育无核葡萄效率很低，杂种后代中无核的几率一般不超过15%，且选育过程时间长。胚挽救技术是运用植物组织培养技术，对假单性结实的或其他发育有障碍的受精胚或者胚珠，在其合子胚败育之前进行离体培养，阻止幼胚败育，利用胚乳及培养基中的营养使其发育成充实的胚，最终形成完整的植株。该技术使无核葡萄×无核葡萄的杂交方式成为现实，是目前无核葡萄育种研究中发展最快的新兴、实用技术，推动了无核葡萄育种的进程。

  在杂交过程中，由于受外源花粉污染与闭花授粉等的影响，可能造成真假杂种苗木混杂的现象，因此进行真杂种早期鉴定是非常必要的。SSR即简单重复序列，在整个基因组广泛存在，多态性高，数量丰富。SSR分子标记技术具有共显性操作简单重复性好结果可靠，快速检测的优点。另外，SSR分子标记可以大大缩短杂交育种时间，并在苗期、甚至是培养室培养阶段即可判断其是否为真正的杂交种。目前已被应用于刺葡萄、山葡萄等的杂种鉴定中。苏聪聪利用SSR标记对刺葡萄F1代杂种进行了真实性鉴定。艾军等利用SSR标记成功鉴定了山葡萄杂交组合‘北冰红’ב贵人香’与‘双红’ב贵人香’杂交后代的真伪性。本研究对三个杂交组合进行了胚挽救，并利用SSR分子标记对由胚挽救技术获得的杂交后代进行杂种的真实性鉴定，为加快无核葡萄育种奠定基础。

  1　材料与方法

  1.1　试验材料

  供试材料为贵妃玫瑰×无核白鸡心、阳光玫瑰×紫甜无核、紫甜无核×阳光玫瑰3个杂交组合由胚挽救技术所获得的53个杂交株系（表1）。取幼嫩叶片于-80℃保存备用。

  1.2　试验方法

  1.2.1　基因组 DNA 的提取和检测

  采集杂交后代的叶片为材料进行基因组DNA 的提取，提取方法参考改良的CTAB 法。经超微量紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测浓度及质量后，将样品浓度稀释至 10ng•μL-1，并于-20℃保存。

  1.2.2　SSR 反应体系、扩增程序及扩增产物的检测

  本试验引物来源有二：一为已发表的引物（Di Gaspero et al.,2005），二为本研究室依据 NCBI中vitis vinifera 18号染色体基因序列中SSR序列设计（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

  扩增反应体系总体积 16μL，其中2 ×Taq PCR Master Mi x8μL，SSR上下游引物各0.5μL（10μ m o l • L -1） ， 模板 DNA（10ng•μL-1）1μL，加ddH2O 定容至16μL。

  PCR 扩增程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性 30s，退火30s（退火温度因引物而异），72℃延伸 1min，27个循环；72℃延伸10min，4℃保存。 PCR 扩增结束后，将扩增产物用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用银染的方法显色并统计。

  1.2.3　杂种 SSR 鉴定

  以4个亲本的基因组DNA为模板，利用以上SSR引物进行各亲本间的多态性分析。选取多态性良好的引物进行退火温度的筛选，根据电泳条带清晰程度确定每对引物的最适退火温度（设置8个梯度)。根据引物筛选的结果进行杂交后代DNA的群体扩增，扩增结果用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并统计条带。每对引物重复试验3次，以确定结果的准确性。

  2　结果与分析

  2.1　基因组 DNA 的提取

  对双亲及53份杂交后代共57份材料的 DNA 浓度和质量进行了检测，提取样品的DNA经超微量紫外分光光度计测定，结果表明峰型光滑，OD260/OD280比值介于1.7-1.9之间，说明没有蛋白质与RNA的污染。1%琼脂糖凝胶电泳检测时，提取的DNA为一条完整清晰的带，并无拖尾，而且点样孔中并无杂质残留。说明DNA的完整性好，纯度高，符合本试验的要求。

  2.2　引物筛选

  将SSR引物在4个亲本统一进行PCR扩增，分别筛选出多态性良好的引物。其中，引物Z10与UDV087分别用于杂交组合GB和YZ（ZY）杂种后代的鉴定。如图2所示，随着温度上升，扩增产物减少，阴影带逐渐消失，特异性提高。但当温度过高，目的条带逐渐消失。

  2.3　杂种后代的 SSR 鉴定

  根据引物筛选结果，选择引物 Z10 对 40株GB杂交后代进行鉴定（图 3）。 由于 SSR 标记为共显性标记，后代中能扩增出具有父本与母本特异性条带的即为真实性杂种。经鉴定，40株杂交后代中14株为真杂种。但是，泳道4、5、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、24只扩增除了母本的特异性条带，推测为母本的自交后代。

  引物UDV087对YZ和ZY组合的13株后代进行鉴定，结果如图4所示，阳光玫瑰×紫甜无核杂交组合中10株为真杂种，泳道7为母本的自交后代。紫甜无核×阳光玫瑰杂交组合2株均为真杂种。

  3　讨论

  种间杂交是获得植物新品种的重要途径，通过种间杂交可以聚合双亲的优点，对杂种后代进行早期鉴定与选择是杂交育种中提高育种效率一个重要环节。由于外来因素的影响，鉴定杂交后代的真伪性，对育种与研究存在重要的意义。SSR稳定性好，操作简单，在，已广泛应用于玉米、水稻、大豆等植物的杂交种鉴定。本研究从30对引物中筛选出2对扩增条带清晰稳定父母本存在多态性的引物Z10与UDV087，用于杂交后代的真伪性鉴定。经鉴定，40株GB杂交后代14株为真杂种，11株YZ杂交后代中10株为真杂种，2株ZY组合后代均为真杂种。

  本研究中GB组合母本阳光玫瑰属欧亚种的中熟葡萄品种，具有果粒大、浓郁玫瑰香气味、风味上佳、品质优良的特点；父本无核白鸡心欧亚种中熟葡萄品种，具有果粒大、果皮薄、果肉硬而脆、自然无核的特点。而YZ组合与ZY的紫甜无核属欧亚种晚熟葡萄品种，具有色泽深沉、果肉较脆、清甜、有牛奶香味、自然无核的特点。通过有性杂交期望产生综合双亲优良特性的无核品种资源。由于根据形态学特征进行早期选择准确性差，采用 SSR 分子标记技术能简单、快速准确地完成真伪性鉴定。这些真实性杂种个体将用于后续的性状观察及无核机理分析等相关研究中。