病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤, 张尊平 张梦妍 任芳 胡国君

  摘　要：‘阳光玫瑰’是我国从日本引进的葡萄优良品种。为了明确我国阳光玫瑰葡萄病毒病的病原，本研究采用小RNA测序技术对2株显症和无症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒鉴定，结果显示：显症样品中测定到8种病毒，其中包含葡萄蚕豆萎蔫病毒（Grapevine fabavirus, GFabV）和灰比诺葡萄病毒（Grapevine Pinot gris virus , GPGV）；无症状样品中测定到3种葡萄病毒。对46个‘阳光玫瑰’样品进行14种葡萄病毒的RT-PCR检测，结果表明：‘阳光玫瑰’葡萄带毒率较高，病毒复合侵染情况普遍；显症样品中，GFabV检出率为88.2%，GPGV和葡萄浆果内坏死病毒（Grapevine berry inner necrosis virus ，GINV）检出率为64.7%和29.4%，均明显高于无症状样品（13.8%和10.3%）。本研究旨在探明‘阳光玫瑰’葡萄携带病毒的种类和侵染状况，为其病毒病防控及病毒脱除奠定基础。

  关键词：阳光玫瑰；小RNA测序；葡萄病毒；RT-PCR

  ‘ 阳光玫瑰’ （ S h i n e -Muscat）葡萄是日本国家果树科学研究所选育的新品种，因其外观美、品质佳、耐储运、栽培效益好而深受我国果农和消费者的喜爱。‘阳光玫瑰’葡萄在我国推广种植过程中，普遍表现叶片变小、褪绿斑驳、畸形等病毒病症状，严重影响果实产量和品质。明确‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的病原及其危害的主要病毒种类迫在眉睫。为明确‘阳光玫瑰’病毒病相关的病毒种类，本研究采用小RNA测序技术对表现症状和无症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒鉴定，随后采用RT-PCR方法对来源于8个省（市）自治区的46个‘阳光玫瑰’样品进行14种葡萄病毒的检测，以期明确‘阳光玫瑰’葡萄的病毒种类及造成危害的主要病毒，为‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的防控和病毒脱除提供依据。

  1　材料与方法

  1.1　材料

  2015年6月于葡萄园中，从表现症状和无症状的邻近2年生‘阳光玫瑰’葡萄树上采集叶片，送北京百迈克生物科技有限公司进行小RNA深测序。显症样品症状主要表现为叶片褪绿斑驳、畸形及小叶。

  2016-2017年，从浙江（5）、上海（10）、云南（4）、福建（2）、武汉（2）、山东（12）、江苏（5）、辽宁（6）等地收集46个‘阳光玫瑰’样品，其中，17个样品在春夏季表现不同程度的叶片褪绿斑驳、畸形、小叶等症状，其余29个样品未表现明显病毒病症状。

  1.2　方法

  （1）小RNA测序及分析 将显症和无症的‘阳光玫瑰’叶片通过干冰运至北京百迈克生物科技有限公司，委托其利用IlluminaHisSeqTM 2000高通量测序平台进行小RNA深测序。获得原始数据后，将长度小于18 nt或大于30 nt、低质量、未插入3’或5’接头、带ployA或ployN的小RNA序列及小RNA的接头序列去掉，获得过滤后的数据（clean data）。采用Velvet 软件对clean data中的小RNA进行拼接，设哈希长度（hash_length）值为17。将拼接得到的片段（contigs）序列与NCBI网站下载的病毒参考数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/viral/）进行本地blastn和blastx，获得病毒的特异性contigs序列。

  （2）RNA提取及反转录 采用柱式提取方法进行总RNA的提取。反转录在1.5 mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水7.0 μL、50 μmol•L-1随机引物（NNNNNN）（上海生工生物工程技术服务公司合成）1.0 μL，总RNA2.0 μL，离心混匀，95℃水浴5 min，冰上放置2min； 加入5 ×M-MLVbuffer 5.0μL、10 mmol•L-1dNTPs1.5μL、200U•mL-1 M-MLV逆转录酶0.8μL、灭菌纯水2.7μL，37℃10min，42℃ 50min，70℃5min。合成的cDNA立即用于PCR扩增或置于-20℃冰箱保存。

  （3）田间‘阳光玫瑰’样品检测 采用RT-PCR方法对46个‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒检测，检测病毒种类为葡萄卷叶相关病毒1~4、7（Grapevine leafrool-associatedvirus 1~4、-7, GLRaV-1~4、-7）、葡萄病毒A（Gr apevine vi rus A ,GVA）、葡萄病毒B （Grapevinev i r u s B , G V B ） 、葡萄病毒E（Grapevine virus E, GVE）、沙地葡萄茎痘病毒（Grapevine rupestris stempitting-associated virus , GRSPaV）、葡萄斑点病毒（Grapevine fl eck virus ,GFkV）、葡萄扇叶病毒（Grapevinefanleaf virus , GFLV）、GPGV、GINV和GFabV共14种。

  2　结果

  2.1　小RNA测序及分析

  对小RNA测序数据进行分析，结果从无症状和显症的‘阳光玫瑰’样品获得的小RNA总数分别为20 518 812和17 216 628，过滤后分别获得17 212 241和14 109 655的clean reads，占小RNA总数的83.89%和81.95%。小RNAs以21nt和24nt为最多，其次为22nt、23nt和25nt。

  2.2　小RNA拼接及注释

  采用Velvet软件对获得的小RNA进行拼接， 并将拼接得到的contigs序列与病毒参考数据库中的病毒基因序列进行比对，结果表明：无症状葡萄样品中存在GLRaV-3、GRSPaV和GFkV3种葡萄病毒；显症葡萄样品中存在GLRaV-3、GRSPaV、GFkV、GVA、GVB、GVE、GPGV和GFabV8种葡萄病毒。拼接得到的病毒序列在病毒基因参考序列的覆盖率高达72.8%～100%，同源性为88.14%～100%。

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  2.3　病毒检测

  在1 7 个表现症状的‘ 阳光玫瑰’ 葡萄样品中， 检测到GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GRSPaV、GVA、GVB、GVE、GFkV、GINV、GPGV和GFabV，检出率依次为5.9%、35.3%，17.6%、58.8%、52.9%、17.6%、29.4%、47.1%、29.4%、64.7%和88.2%。在29个无症葡萄样品中，检测到GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV- 4 、GRSPaV、GVA、GVB、GVE、GFkV、GINV和GPGV， 检出率分别为6.9%、62.1%、3.4%、20.7%、31.0%、27.6%、65.5%、27.6%、10.3%和13.8%。GFabV仅在显症的‘阳光玫瑰’葡萄上检测出，检出率为88.2%。除GFabV外，在显症和无症‘阳光玫瑰’葡萄样品上检测出的病毒种类相同，但GINV和GPGV在显症样品中的检出率（29.4%和64.7%）明显高于无症样品（10.3%和13.8%）。

  3　小结

  本研究采用小RNA测序技术对无症状和表现症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品分别进行病毒种类鉴定，无症样品中检测出3种葡萄病毒，显症样品中检测到包括GFabV和GPGV的8种葡萄病毒。对46个‘阳光玫瑰’样品的病毒RT-PCR检测结果显示，GFabV仅存在于显症样品中，在显症样品中GINV和GPGV也有较高的检出率。据此推测，这3种葡萄病毒，尤其是GFabV，可能与‘阳光玫瑰’葡萄病毒病发生密切相关。对于多种病毒复合侵染的现象，很难判断到底是哪一种病毒引起的症状。因此，对于上述推测，还需通过单一毒源嫁接传染实验、侵染性克隆接种实验等予以证实。

  本研究结果显示，除上海的绝大部分样品未检测到病毒外，其他显症和未显症的样品中均检出多种葡萄病毒。究其原因，可能是‘阳光玫瑰’自日本引进后在各地栽培过程中，频繁采用携带病毒材料（接穗和砧木）繁殖和昆虫介体传毒所致。一些葡萄病毒通常不会引起葡萄扇叶病类似症状，在无症状的‘阳光玫瑰’中虽能被检测到，但通常表现为潜隐。葡萄病毒病无有效药剂进行防治，种植脱毒苗木是目前唯一有效的防控措施。探明‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的主要致病病毒，对培育脱毒苗木至关重要。

  本研究明确了感染病毒病的‘阳光玫瑰’上的主要病毒种类及其侵染率，为明确该葡萄品种病毒病的发生情况提供了重要依据，也为该病毒病致病因子、病毒脱除及其防控技术研究奠定了基础。