熟期调控岗位

唐婉莹 谭君 白描 陈文婷 杨国顺

  葡萄果实香气是构成葡萄内在品质的重要指标之一，也是葡萄果实及其加工产品典型风味特征和品质的重要性状。普遍认为葡萄品种香气是葡萄与生俱来的品性之一，含有品种、产地等标志性特征，因而近年来逐渐被作为葡萄与葡萄酒的指纹性特征而被密切关注。过去对葡萄成熟期的研究主要集中于糖、酸含量及其比值，而对芳香成分的研究相对滞后。

  葡萄果实中有数百个化合物与香气有关，主要以游离态和糖苷结合态形式存在。这些香气物质可根据其代谢路径分为萜烯类、C13-降异戊二烯衍生物、芳香族化合物、挥发性脂肪族化合物、吡嗪类化合物、含硫化合物，不同香气化合物所呈现的香气感官特征不同。

  Gunata等根据果实中的香气成分将欧洲葡萄品种分成玫瑰香型品种、非玫瑰香的芳香型品种和非芳香型品种。葡萄属中不同的种、品种甚至营养系等内因之间的差异，都可导致其香气组成上的不同；而栽培技术、环境因素等外部因素，也会造成葡萄香气物质的显著差异。

  1　材料与方法

  1.1　实验材料与试剂

  巨玫瑰、阳光玫瑰、户太八号和夏黑无核四个品种新鲜葡萄果实。全氘代同位素内标物：氘代苯酚和氘代正丁醇。甲酸甲酯、异丙醇、叔丁醇、甲基叔丁基醚、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯等63种香气物质的标准品分别购买于百灵威科技有限公司和阿拉丁试剂公司，具体的化合物列入表1中。

  1.2　仪器与设备

  Agilent 7890B-7000C气相色谱-三重四级杆串联质谱仪（GC-QqQMS/MS）配备EI离子源和CI离子源，毛细管柱为DB-WAX IU毛细管柱气相色谱柱（30m×0.25mmID×0.25μm thickness）；57357-U固相微萃取（SPME）操作平台，配备磁力加热搅拌器；57330-U型SPME手动进样手柄；PDMS/CAR/DVB（50/30um）固相微萃取头（Supelco，美国）；KQ5200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

  1.3　试验方法

  1.3.1　GC-MS 检测方法

  载气为高纯氦气（99.9995%以上），流速为lml/min，分流进样模式，分流比1:10，进样口温度200℃，柱升温程序：起始温度30℃保持5min，以2℃/min的速度升温至100℃保持1min，最后以10℃/min的速度升温至250℃。质谱接口温度为220℃，离子源温度为230℃，电离方式El，离子能量70ev。以Scan模式定性分析，质量扫描范围为45-300u；以SIM模式定量分析，同位素内标法计算含量。

  1.3.2　样本采集方法

  葡萄果实因受光面及营养运输的影响，导致一穗果实的不同部位的葡萄有一定的差异性，在进行葡萄果实采集时，每个品种选取3株树，每株在东西南北面各选取一穗果实，从每穗果的上中下部各取10-15颗左右。放置在-70℃冰箱保存。

  1.3.3　样品前处理方法

  取100g葡萄果实，搅碎后准确移取5mL于样品瓶中，加入2.0gNaCl，拧紧瓶盖后置于40℃的磁力搅拌加热台，搅拌20min，插入SPME探头萃取20min，将探头拔出后迅速插入GC-MS进样口，进行仪器分析。

  2　结果与分析

  2.1　定性定量分析方法

  2.1.1　多方法联合定性

  将所有四个品种的葡萄样本搅碎后，按照相同比例混合均匀，取其中50mL作为质量控制（QC）样本，同1.3.3的操作方法对QC样本进行Scan全扫描分析，结合NIST14标准质谱数据库，采用解卷积方法查找化合物信息，提取QC样品香气物质的定性化合物信息。通过方法对比证实，采用解卷积方法能够有效的过滤系统背景和样本基质的干扰，提高化合物数据库的匹配度，从而大大增强定性的可靠性。

  此外，通过与各香气物质的标准品进行保留时间比对进行二次定性确证。采用极性与非极性两种不同色谱柱的“双柱”保留时间验证的方法，对葡萄果实中香气物质的化合物组成进行精准的分离与定性。

  2.1.2　同位素内标SIM定量

  优化各仪器参数，建立63种香气物质定量分析的SIM方法（表1），以氘代苯酚和氘代正丁醇作为内标物质，绘制同位素内标工作曲线，对葡萄样品中的香气物质进行准确的定量分析与含量计算。该方法在以下几个方面具有明显的优势与特色：（1）避免长时间样本检测过程中，外标法的线性逐渐下降，准确度不高，需要经常校准外标工作曲线的问题；（2）同位素内标物的选择，有效解决复杂样本基质中存在的物质干扰问题；（3）二项式非线性拟合方程的运用，有效解决待测物含量范围宽，所造成的线性拟合不佳的问题。

  2.2　葡萄果实中各种香气物质的含量分析

  采用Scan全扫描方式结合面积百分比法，分别对上述四种葡萄果实中的香气物质进行定性与出峰面积的半定量分析，结果如下图1所示。在四个品种中共检出193个香气组分，其中主要组分28种（占总量的97.3%以上），含量最高的物质依次为2-己烯醛（39.6%）、正己醛（26.15%） 、乙酸乙酯（13.5%）和正己醇（3.28%），且2-己烯醛、正己醛、乙酸乙酯和丙基环氧烷在不同样本中的分布差异较大，分布区间变化范围较宽。

  2.3　不同品种葡萄中香气物质的主成分分析

  对不同品种葡萄果实中的香气物质进行主成分分析，由图3中左图的主成分分析散点图可见，2-己烯醛、正己醛和反式-2-己烯醛为样品之间香气物质组成差异影响最大的组分。由主成分分析得分图（图2右）对数据进行分类，发现阳光玫瑰的香气物质与其他三个品种之间呈现明显差异。

  2.4　不同成熟时期的葡萄中总香气物质含量差异

  对比3个户太八号样本、3个巨玫瑰样本和5个夏黑无核样本，对其中的香气物质峰面积进行加和计算，对不同样本中的香气物质总量进行比较发现（图3），巨玫瑰和夏黑无核的样本间差异较大，而户太八号香气物质含量变化相对较为稳定。巨玫瑰香气物质随着果实成熟逐渐增多，到达成熟期后反而大幅度减少；夏黑无核的香气物质随着果实成熟呈现小幅度的减少趋势，在成熟期则含量明显降低。由此推测，不同品种的葡萄在果实成熟的过程中，香气物质变化规律呈现显著差异；并且其香气物质含量最丰富的时期并非为果实成熟期。

  此外，在所有样本中均含有2-己烯醛且含量最高，且随着果实成熟度加强其含量增多，但夏黑无核果实中的2-己烯醛含量无明显变化。主成分正己醛和乙酸乙酯也普遍存在于不同葡萄品种，但随着果实成熟度加强而呈现减少的趋势。