酿酒微生物岗位

刘延琳团队

  1　概述

  戴尔有孢圆酵母（Torulasporadelbrueckii，T. delbrueckii ）作为当前研究最多的非酿酒酵母之一，是葡萄表面天然微生物群的典型代表。早在1954年，戴尔有孢圆酵母就因高的酒精发酵力而被作为发酵启动菌。2003年，戴尔有孢圆活性干酵母首次商业化。随后，CHRHansen、Lallemand和Laffort公司纷纷推出了单一商业戴尔有孢圆酵母（Benito 2018）。

  最新研究显示，不同菌株T.delbrueckii 的发酵参数存在显著差异。T. delbrueckii 的挥发酸生成差异约为0.11 g/L（Escribano et al.2018），甘油含量差值能达1 g/L；乙醛、乙偶姻、双乙酰、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇、1-丁醇、乙酸苯乙酯、异丁酸、异戊酸和γ-丁内酯等挥发性物质的差异超过25%（Benito, 2018）；苹果酸的消耗率差异接近19%（Bely 2018）。由于T. delbrueckii 表现出极强的菌株差异性，因此了解T. delbrueckii 的发酵共性，筛选发酵性能优异的菌株，根据实际生产情况选择合适的菌株，制定相应的发酵策略十分重要。

  2　戴尔有孢圆酵母对发酵的影响

  2.1　发酵动力

  在葡萄酒酿造过程中，纯种戴尔有孢圆酵母进行酒精发酵耗时长，且当葡萄汁中含糖量较高时难以完成发酵，因此多采用与酿酒酵母混合发酵策略。研究显示与S. cerevisiae 单独发酵相比，T.delbrueckii 与S. cerevisiae 顺序接种发酵时间延长了2-5 d（Velazquez etal. 2015; Belda et al. 2017）。对混合发酵过程中的菌落动态变化进行监控，结果显示酿酒酵母的接入导致戴尔有孢圆酵母数量的急剧减少（Taillandier et al. 2014; Azzolini etal. 2015）。这种现象不仅与营养物质的竞争相关，还受细胞间接触机制的调控。Velázquez et al（2015）研究发现，相对于无噬杀性的T.delbrueckii，有嗜杀性的T. delbrueckii在发酵过程中能更好的占据主导地位，且成品酒口感更好，香气复杂。Taillandier et al（2014）发现T.delbrueckii 和S.cerevisiae 之间的竞争随着培养基中初始可同化氮浓度的增加而减弱。

  2.2　乙醇

  由于全球气候变暖导致的葡萄原料初始糖浓度升高及消费者对健康的注重，低酒精度酒的需求日益增加。相关研究表明T. delbrueckii 在低醇葡萄酒生产过程中具有积极作用。纯种T. delbrueckii发酵能产生9%左右的乙醇。Belda et al（2015）对发酵过程中酵母数量的动态变化进行监控，发现当乙醇含量超过8%，T. delbrueckii数量急剧减少，尽管直到酒精发酵结束仍有活细胞存在，但却几乎不再工作。因此，对于那些乙醇含量要求较低的啤酒或气泡葡萄酒可以T. delbrueckii 纯种发酵的方式（Canonico et al. 2016）。对于乙醇含量要求较高的葡萄酒则可以通过混菌发酵以确保发酵的顺利完成。Puertas et al（2017）将T.delbrueckii TD291和S. cerevisiae QA23顺序接种酿造霞多丽葡萄酒，与酿酒酵母单独发酵相比，乙醇含量降低0.5%。此外，发酵过程中适量的通氧，乙醇含量的减少可提高至1.5%（v/v）（Contreras et al. 2014）。然而，也有报道显示接种戴尔有孢圆酵母的发酵液中乙醇含量与酿酒酵母纯种发酵并无显著差异（Renaultet al. 2015; Chen et al. 2018）。

  2.3　甘油

  甘油要来源于酵母发酵，是萄萄酒中含量较高的成分之一，能改善葡萄酒的口感，提升酒体的丰满度。早先，工业上非酿酒酵母的使用多数就是为了增加葡萄酒中甘油含量（Jolly et al. 2014）。研究显示与传统的酿酒酵母发酵相比，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母顺序接种发酵，甘油含量增加0.1-1 g/L不等（Belda et al. 2017; Medina-Trujilloet al. 2017），且甘油的增加与乙醇含量的降低相关。此外，也有研究表明混合发酵过程中T. delbrueckii甘油产量的增加与丙酮酸生成的增加相关（Belda et al. 2015; Lu et al.2016），发酵结束后高vitisin A水平在一定程度上也证明了这一结论（Bañuelos et al. 2016）。然而，也有研究报道戴尔有孢圆酵母的甘油产量与酿酒酵母无显著差异（Minnaar et al. 2015）。

  2.4　有机酸和乙酸

  有机酸是葡萄酒的风味物质之一，适量的有机酸不但能平衡口感，赋予酒醇厚感和清爽感，还能稳定色素，帮助陈年。苹果酸是葡萄中主要的有机酸之一，酸度大，含量过高会带来酸涩口感。Plessis et al（2017）对6株T.delbrueckii 的降酸性能进行研究，结果显示苹果酸含量减少了0.7 g/L左右。Belda et al（2015）和Chen etal（2018）也得到了相似的实验结果，将T. delbrueckii 和S. cerevisiae 顺序接种发酵，苹果酸的消耗率分别为20%和25%。然而，Banuelos et al（2016）却得到了相反的结果，与S. cerevisiae相比，顺序接种发酵苹果酸增加了0.83 g/L。这表明苹果酸的降解能力存在显著的菌株差异性。

  此外，T. delbrueckii 对苹果酸的降解能力很大程度上也受基质中氧含量的影响（Contreras et al. 2014）。琥珀酸作为发酵酸，对葡萄酒的酸味和酒体的稳定性具有重要影响。早在1998年就有报道称T.delbrueckii是琥珀酸高产菌（Ciani etal. 1998）。近年来的研究也得到相似结果，T. delbrueckii 和S. cerevisiae混合发酵，琥珀酸增加了约0.46 g/L（Puertas et al. 2017），在通氧的条件下增加量能达1 g/L（Contreraset al. 2014）。然而，由于琥珀酸特殊的苦味和咸味，过量的水平可能会对葡萄酒的口感造成负面影响。挥发酸的主要成分是乙酸，对葡萄酒的质量至关重要。当葡萄酒中乙酸含量超过0.8 g/L，就能感觉到明显的醋味。大量研究显示T. delbrueckii 参与的发酵，发酵结束后乙酸水平显著降低（Chen etal. 2018; Taillandier et al. 2014）。

  Bely et al（2007, 2008）采用不同的发酵策略酿造贵腐葡萄酒，其中T. delbrueckii 与S. cerevisiae 以20:1的比例同时接种挥发酸含量降低53%。此外，菌株差异（Loira et al.2014）、葡萄原料（Azzolini et al.2015）以及发酵条件（Contreras etal. 2014）都会影响乙酸的含量。

  2.5　挥发性成分

  目前，国内外对T. delbrueckii 的研究多数集中在其对葡萄酒香气及风味的影响。戴尔有孢圆酵母可以通过增加或降低一些挥发性物质的含量（如2-苯乙醇、萜烯类物质、脂肪酸、乙酸酯等）来影响葡萄酒的香气。酯类是葡萄酒香气构成的重要成分，给葡萄酒带来浓郁的果香。Renault等（2015）发现接种T.delbrueckii 的混合发酵显著提高了红葡萄酒的复杂性和水果风味，主要是因为乙酸异戊酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯和肉桂酸乙酯等物质含量的增加。Loira等（2014）也报道T.delbrueckii 参与的发酵生成大量的乳酸乙酯和乙酸苯乙酯，且总酯含量与菌株相关。Puertas等（2018）评估了不同酿造策略对Chardonnay和Verdejo两种白葡萄酒的影响，结果显示顺序接种发酵成熟果味提升，自然发酵核果类香气提升，并且酯类物质被认为是区分不同发酵策略的标志产物。

  高级醇是葡萄酒挥发性成分中含量最高的一大类物质。研究报道T. delbrueckii 的高级醇产量比S.cerevisiae 低70-90 mg/L（Belda et al.2017）。但Azzolini（2015）却获得了相反的实验结果，接种两株不同的T. delbrueckii 发酵结束后发酵液中高级醇分别增加了19%和38%，其中甲硫醇的2-苯乙醇增长显著。这可能是由于调控高级醇生成的埃利希途径在不同菌株之间差异很大。Loira等（2014）评估了5株T. delbrueckii 的发酵性能，高级醇产量存在明显的菌株差异性，与酿酒酵母相比，有的菌株的高级醇含量提高了80mg/L，有的反而降低了40mg/L。

  此外，Whitener等（2017）发现某些特定的戴尔有孢圆菌株能提高长相思等葡萄的品种香气，因为其能促进香叶醇和萜品醇等萜烯类化合物的释放。挥发性硫醇是长相思、雷司令等品种重要的香气组成成分，某些特定的菌株具有高硫醇释放活力。Belda等（2017）报道T. delbrueckii 与S .cerevisiae 的顺序接种发酵，3-硫基-1-己醇（3-sulfanylhexan-1-ol，3-SH）和4-甲基-4-(甲基磺酰基)-2-戊酮（4-methyl-4-sulfanylpentan-2-one，4-MSP）分别增加了100 ng/L和70 ng/L。

  2.6　其它指标

  T. delbrueckii 参与的发酵对葡萄酒的口感有一定程度的提升，主要是因为甘露糖蛋白和多糖的增加。与S. cerevisiae纯种发酵相比，顺序接种T.delbrueckii 和S .cerevisiae ，甘露糖蛋白提高25%（Belda etal. 2015），T. delbrueckii 纯种发酵，多糖提高50%（Domizio et al.2014）。

  葡萄酒中酚类物质决定了葡萄酒的色泽、口感和香气等感官特性。Chen et al（2018）将T. delbrueckii 和S .cerevisiae 混合发酵，发酵液中总花青素提高46 mg/L。Ngqumba et al（2017）考察T. delbrueckii （654和M2/1）与S.cerevisiae （VIN13）发酵对品丽珠葡萄酒酚类物质和感官特征的影响。ANOVA分析显示M2/1+VIN13酿造的葡萄酒多酚和花色苷含量更高，酒口感和收敛性提高。