种质资源收集与评价岗位
李贝贝 樊秀彩 张颖 姜建福 刘崇怀
摘要：中国是葡萄的起源中心之一，并且拥有丰富的野生葡萄资源。利用国际通用的9对SSR引物对124份葡萄种质的遗传多样性及亲缘关系进行了分析。结果表明：9对引物共扩增出196个等位基因，多态性位点为196个，多态性比率达100%，每个标记检测到的位点数在19-29之间，平均为21.77个。多态性信息含量（PIC）值变幅在0.88-0.95之间，平均值为0.91。本研究发现武植-1为网脉葡萄，木札岭-5、木札岭-6为桦叶葡萄，南湾湖1402可能为毛葡萄与桑叶葡萄的过渡种。聚类分析结果表明，124份供试材料可以被完全区分开，并且分为15个类群。
葡萄是世界上最重要的济作物之一，具有悠久的栽培历史。目前全世界葡萄属植物有70余种，它们主要分布于北半球。中国是葡萄的起源中心之一，至少有38个种起源于中国，野生葡萄在中国大多数省份均有分布，尤其是江西、湖南、浙江省分布较多。不同分类学家对部分中国野生葡萄的分类持不同观点，目前，部分中国野生种的分类仍存在一定的争议和困惑。利用9对微卫星标记对124份葡萄材料的遗传多样性进行分析，所获得的基因型数据经过校准后可应用于国际数据库（www.vivc.de），有利于数据共享。
1 材料与方法
1.1 试验材料
123份葡萄种质资源均取自于中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质郑州葡萄圃（表1）。采取植株的幼嫩叶片，并用液氮处理后保存于-80℃备用。
1.2 DNA提取
利用艾德莱植物基因组DNA提取试剂盒对基因组DNA进行提取，用1%琼脂糖凝胶对DNA质量进行检测，保存于-20℃。
1.3 SSR引物筛选及PCR扩增
选用国际上通用的品种鉴定或指纹数据库建立的多态性较高的9对引物（表1）进行扩增。所有引物的正向引物５′端使用荧光标记。采用20 LPCR反应体系：10×Buffer（含Mg2+）2.0μL，dNTPs（2.5mmol /L）2.0μL，DNA模板（50ng/μL）2.0μL，EXTaq酶（5U/μL）0.2μL，上下游引物（10mmol/L）各1.0μL，ddH2O补足20μL。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，适温退火30s（不同引物，退火温度不同），72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。扩增产物采用毛细管电泳检测：在96孔样板的每个孔中分别加1μL稀释后的PCR产物，0.5μLROX500分子量内标和8.5μL甲酰胺，离心，95℃变性3min，于ABI3730XL全自动基因测序仪上进行电泳检测。
1.4 SSR数据分析
毛细管荧光电泳结束后，利用软件GeneMapper v3.25对ABI3730XL分析软件中导出的原始数据进行分析，对最终得到的多态性片段进行统计，有峰的记为“1”，无峰的记为“0”，缺失数据记为“999”，形成“1/0”矩阵。利用PopGene version 32软件计算基因多态性信息含量值。采用UPGMA（Unweighted pair group witharithmetic mean）方法生成聚类图。
2 结果与分析
2.1 SSR引物扩增多态性分析
利用9对SSR引物在124份供试材料中进行扩增，共扩增出196条带，均具有多态性（表2）。每对引物平均扩增出21.78条带，其中引物VVMD28最多，为30个；VrZAG79最少，为19个。9对SSR引物PIC值变化范围为0.88-0.95，引物中没有低度多态性引物，表明9对SSR引物能反映出葡萄种质的基因型多样性水平，可用于分析葡萄种质的遗传多样性水平。
2.2 聚类分析
利用UPGMA法构建遗传关系聚类图（图1），聚类结果表明：圆叶葡萄亚属的4份圆叶葡萄，即弗莱、朱姆博、萨米特、代克赛，与属于真葡萄亚属的品种分开，单独聚为一类。其余真葡萄亚属的供试材料分为15个组。组1及组2均只包含一个种，即小叶葡萄和河口葡萄。组3为4份网脉葡萄。组4为乳源葡萄。组5为4份华东葡萄。组6包括菱叶葡萄，东南葡萄，闽赣葡萄，云南葡萄。小果葡萄，毛葡萄，蘡薁葡萄组成了组7。组8主要包括腺枝葡萄。来自于北美种群
的6个野生种聚在组9。组10为武汉葡萄。组11为刺葡萄。组12为桑叶葡萄。组13主要包括了4份山葡萄和1份燕山葡萄。组14包括3份秋葡萄，4份桦叶葡萄，2份变叶葡萄和2份陕西葡萄。所有的欧亚种聚在了组15。圆叶葡萄亚属与真葡萄亚属能聚类分开，大多数中国野生葡萄以种为单位单独聚为一组，但也存在多个种聚为一组的情况，说明这些中国野生葡萄种具有较近的遗传关系。
3 讨论
聚类结果显示，大多数中国野生葡萄单独聚为一类，但有一些例外。如第6组中，东南葡萄、菱叶葡萄和闽赣葡萄聚在一组，可能是由于这三个种的叶形较狭窄，依据李世诚对葡萄叶形进化的研究，推测它们可能属于较原始的种类而聚在一起。此外，闽赣葡萄与云南葡萄聚在了一组。在第12组中，来自于河南的毛葡萄‘南湾湖1402’与桑叶葡萄聚在了一组。然而，据植物志记载，河南不生长毛葡萄。通过观察该材料的形态特征，发现它既具有毛葡萄的特征又具有桑叶葡萄的特征，因此我们推测‘南湾湖1402’可能是两个种的过渡种。通过对聚类结果分析，对3个分类地位尚不明确的野生种进行初步鉴定。前期依据形态特征，将‘武植-1’初步判定为网脉葡萄，聚类结果显示‘武植-1’与网脉葡萄聚在一组，进一步从分子水平上证实了‘武植-1’为网脉葡萄。
‘木札岭-5’‘木札岭-6’与桦叶葡萄具有相似的形态特征，聚类结果显示两者与桦叶葡萄聚为一组，因此推测‘木札岭-5’‘木札岭-6’属于桦叶葡萄。