酿酒微生物岗位

刘延琳团队

　　摘　要：为研究低产硫化氢酿酒酵母对可同化氮的需求，以四株本土低产硫化氢酿酒酵母为研究对象，以含有100、200、300和400 mg/L可同化氮的模拟葡萄汁为发酵基质，监测酵母在酒精发酵中的生长量、CO2和H2S释放量等理化指标。结果表明：可同化氮浓度和四株酿酒酵母的最大生物量、CO2释放量、挥发酸、总酸、pH值显著正相关（P＜0.01），而与酒精度和残糖显著负相关（P＜0.01）；可同化氮浓度与硫化氢释放量没有显著相关性，可同化氮浓度没有改变菌株低产硫化氢的特征，但发现随着葡萄模拟汁pH值的升高，有三株酿酒酵母的H2S释放量增加。

　　关键词：可同化氮；硫化氢；酿酒酵母；pH；模拟葡萄汁

　　葡萄汁中含氮化合物的含量和比例，因葡萄品种、栽培方式、采收时间等因素的不同而存在差异。氮源的存在形式包括：铵离子、氨基酸、多肽和蛋白质，但是只有铵离子和一些氨基酸可以被酵母吸收利用，此类氮源称为酵母可同化氮。在无其它限制因素情况下，可同化氮决定酵母细胞生长速度和酒精发酵速率，影响发酵过程中微生物的代谢，导致葡萄酒中化学成分的差异。

　　在葡萄酒酿造过程中，酿酒酵母除了进行酒精发酵外，还会利用其自身的硫酸盐还原途径，代谢生成H2S。H2S具有臭鸡蛋的气味，且阈值很低，即使少量的H2S也会严重损坏葡萄酒感官质量。酿酒酵母的基因背景差异是造成H2S释放量不同的主要原因。同时，还有很多因素影响酵母产H2S，例如，碳源、氮源、硫源、温度等不同的培养条件。因此，酿酒酵母代谢产H2S受菌株遗传背景和环境的双重影响，不同菌株在同一环境的H2S释放量不同，同一菌株在不同环境下的H2S释放量也存在差异。氮源对H2S产量的影响由于受不同菌株对氮源的需求和产H2S能力的不同而具有多变性。大量研究发现发酵过程中H2S的总产量与发酵液中的氮含量成反比。氮源的缺乏会消除产物对硫代谢的反馈抑制调控，从而导致硫代谢相关基因的去阻遏，增加H2S的释放。通过提供足够的YAN以确保足够的氨基酸前体物质来限制H2S的形成已经被普遍接受。然而，最近的研究发现添加YAN不仅不会减少H2S的产生，甚至在某些情况下会加剧H2S的释放，并具有菌株依赖性。说明YAN和菌株的遗传背景共同决定了发酵过程中H2S的释放量。

　　葡萄汁中含有酵母生长需要的所有营养，但在酿酒环境下，酵母细胞的生长通常因为氮的缺乏而受到抑制，可能会造成发酵迟滞和H2S释放量的增加。目前，最常见的处理方法是向葡萄醪中添加磷酸氢二铵或磷酸铵，不仅可以提高发酵速率，也能有效降低H2S的产量。但是，若添加不当，也会产生适得其反的效果。因此，了解每个菌株的具体氮需求，可有效降低发酵迟滞和H2S大量生成的风险。基于上述分析，本研究以课题组筛选到的四株本土低产硫化氢的野生型酿酒酵母为研究对象，利用模拟葡萄汁，探索了不同初始可同化氮质量浓度对它们的生长及产H2S的影响，意图寻找出在不同初始可同化氮（尤其是低氮）质量浓度下低产或不产H2S的酿酒酵母，有助于本土酿酒酵母的应用。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料与试剂

　　酿酒酵母11 2 y 4 、4 1 y 5 、182y12、174y1是由西北农林科技大学葡萄酒学院筛选的4株本土野生型低产H2S酿酒酵母。酵母浸粉、蛋白胨、肌醇、磷酸氢二铵、氯化钙、吐温80、95%乙醇、甘油、氢氧化钠、氢氧化钾等均为国产分析纯；葡萄糖、果糖、无氨基酵母氮源（yeastnitrogen-base，YNB）、麦角固醇、L-脯氨酸、L-精氨酸 北京索莱宝科技有限公司；L-（+）酒石酸、L-（-）苹果酸、无水柠檬酸 阿拉丁试剂（上海）有限公司；水解酪蛋白、半乳糖 美国Sigma公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　培养基

　　YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L；固体培养基中添加琼脂20 g/L。T r i p l e M 培养基： 参照Spiropoulos等，Martínez-Moreno等和Beltran等的配方。模拟汁分别由储液A、储液B和储液C组成，储液A为糖类，储液B为酸类，储液C为可同化氮源及微量元素等。先将储液B、C混合，再与储液A混合。用4 mol/L KOH调节pH值至3.25，0.22μm滤膜过滤除菌，现用现配。

　　1.2.2　试验设计

　　实验在西北农林科技大学葡萄酒学院实验室进行，研究了不同质量浓度可同化氮对模拟葡萄汁发酵产H2S的影响，同时验证了pH与酵母H2S释放量间的正相关关系。本实验将可同化氮质量浓度设为100、200、300和400 N mg/L，即N100、N200、N300和N400；将pH的初始值设为3.2、3.6和4.0。研究表明，N100是氮缺乏的水平，N200、N300和N400则为酵母提供了充足的氮源，其中N300为正常氮源水平。

　　1.2.3　指标测定

　　采用四种质量浓度的可同化氮源（N100、N200、N300和N400）Triple M培养基发酵。发酵体积为300 mL，发酵温度为20℃，静止发酵。酵母的接种量为5×106 cfu/mL，每个实验组均有三个平行。发酵期间每24 h称量发酵损失质量，监测CO2质量损失，直到连续两次质量损失不变，此时认为发酵中止。在发酵期间（每隔24 h）及发酵结束后分别取样进行各项指标测定。

　　（1）发酵过程中各指标的测定

　　酵母生物量利用分光光度法在560 nm波长处测定；硫化氢利用H2S检测管测定，单位以μL/L计。

　　（2）发酵后基本指标的测定

　　还原糖含量的测定采用王春晓等人的方法；根据国标GB/T15038-2006分析检测发酵液中酒精度、总酸和挥发酸的含量。

　　1.3　数据分析

　　采用SPSS 20.0软件进行数据分析处理，方差分析采用Duncan检验法，相关性分析采用Pearson相关分析，双侧检验计算线性相关关系的显著性，每组实验3个重复。采用ORIGIN 8.5软件进行绘图。

　　2　结果与分析

　　2.1　可同化氮质量浓度对酵母生长的影响

　　由图1可知，四个菌株的生物量在生长平稳期均随初始可同化氮质量浓度的升高而增加，这与姜越等人的研究结果不同，可能是因为菌株的不同而造成差异。其中，菌株174y1在四个初始可同化氮质量浓度下，最大生物量均最高。当初始可同化氮质量浓度为N100时，菌株41y5在发酵初期存在生长停滞的风险，说明N100可同化氮质量浓度过低，不能完全满足菌株41y5的生长需求。而其余三个菌株在四个初始可同化氮质量浓度下，对数生长期的生物量均无明显差异。这说明，当菌株处于对数生长期时，可同化氮质量浓度对其生长的影响因菌株的不同而存在差异；在发酵初期，氮源充足的情况下，即初始可同化氮质量浓度高于N100时，添加氮源对菌株的生长速度无明显影响，这与Taillandier等人的研究结果相一致。

　　2.2　可同化氮质量浓度对酵母发酵速率的影响

　　由图2可知，菌株的发酵速率先快速升高，后缓慢降低直至稳定，且均在48 h-144 h内达最高发酵速率。在四个不同初始可同化氮质量浓度下，菌株174y1的发酵周期均是最短的，说明其在发酵速率上明显优于其余三个菌株，更适于不同初始可同化氮质量浓度的快速发酵。当初始可同化氮质量浓度为N400时，四个菌株的发酵周期均最短，这与Beltran等人的研究一致，增加初始可同化氮的质量浓度，有助于缩短发酵周期，加快发酵速率。当初始可同化氮质量浓度为N100和N200时，尤其是N100，菌株174y1和182y12在发酵初期速率迟缓，存在发酵停滞的风险，而对于菌株41y5，发酵初期可同化氮质量浓度的不同对其发酵速率无明显影响，这说明不同的菌株可能适用于不同的发酵环境，了解发酵所用菌株的氮需求十分必要，可避免过度添加或氮含量不足对酒精发酵形成不良影响，对葡萄酒的质量造成损害。

　　2.3　模拟葡萄酒的基本指标

　　由表1可知，不同的初始可同化氮质量浓度造成了四个菌株发酵后各基本指标存在差异，且不同菌株对于递增的初始可同化氮质量浓度指标变化趋势不同，说明发酵后模拟酒的基本指标由可同化氮质量浓度和菌株共同决定，因此了解每个菌株在不同可同化氮浓度下的酒精发酵情况十分必要，可根据需求选择相应的菌株。除了菌株112y4，其它三个菌株的模拟酒中，pH均随初始可同化氮质量浓度的升高而增加，这与Akin 等人的研究结果一致，酒精发酵后的培养基pH与可同化氮存在关系。与之前的研究不同，菌株41y5和112y4发酵后模拟酒中的酒精度均随初始可同化氮质量浓度的升高而降低。菌株174y1在四个初始可同化氮质量浓度下的酒精度均高于其它三个菌株。

　　2.4　可同化氮质量浓度对酵母产H2S的影响

　　由图3可知，在四种初始可同化氮质量浓度下，四个菌株均为低产或不产H2S菌株。在N300时，四个菌株的H2S产量没有显著差异。对于同一个菌株而言，41y5在N400下H2S释放量显著较高，112y4在四种条件下H2S释放量没有差异，174y1在N200时H2S释放量显著较高，而182y12在N100时H2S释放量显著较高，说明可同化氮质量浓度对菌株产H2S的影响不同。这与Sturgeon等人的研究一致，发酵过程中，H2S的产量由氮源和酵母菌株共同决定。

　　2.5　四个菌株的生长、发酵速率和模拟酒中基本指标的相关性分析

　　如表2所示，对初始可同化氮质量浓度、OD560的最大值、CO2释放的最大速率、酒精度、残糖、挥发酸、总酸、pH和H2S释放量9个指标进行了相关性分析。其中，初始可同化氮质量浓度与其它大多数指标均呈极显著相关，与OD560最大值、CO2释放最大速率、挥发酸、总酸、pH呈极显著正相关，与酒精度和残糖呈极显著负相关；OD560的最大值与CO2释放最大速率、挥发酸、pH、硫化氢释放量呈极显著正相关；CO2释放最大速率与总酸、pH呈极显著正相关，与残糖呈极显著负相关，与酒精度呈显著负相关；酒精度与残糖、H2S释放量呈显著正相关，与总酸呈极显著负相关；残糖与pH呈显著负相关；挥发酸与总酸、pH呈显著正相关；pH与硫化氢释放量呈显著正相关。因此，对于四个菌株，H2S的释放量均与菌株的生长有着极显著的正相关关系，与发酵后的酒精度、挥发酸和pH值存在显著的正相关关系。之前的研究也表明了菌株的生长会影响H2S的释放，但是并没有研究去证明pH与发酵过程中H2S释放量之间的关系，仅Bekker等人研究了不同pH对装瓶后葡萄酒中挥发性含硫化合物的影响，发现pH越低，H2S含量越低。

　　2.6　pH对酵母产H2S的影响

　　由图四可知，除了菌株174y1在三个pH下均不产硫化氢，其余三个菌株的H2S释放量均随pH的升高而增加，说明pH确实会影响H2S产量，且呈正相关关系。由之前的分析可知pH与最大生物量呈极显著正相关，因此，有可能是高的pH促进了酿酒酵母的生长，从而促进了H2S释放量的增加。

　　3　结论

　　本实验对四株本土酿酒酵母在不同初始可同化氮质量浓度的模拟汁中酵母生物量、发酵速率和H2S释放量等发酵特性进行了比较分析，结果表明：模拟汁中初始可同化氮的质量浓度越高，酵母的生物量越大，发酵周期越短。在发酵过程中H2S的释放量与发酵后模拟酒的pH值存在显著的正相关关系，且通过试验得以证实。与其它三株酵母相比，菌株174y1在三种初始可同化氮质量浓度下，生物量均最高，发酵周期均最短，在模拟酒中，其酒精度也显著高于其它菌株，还原糖利用率较高，酸度高，发酵性能优良，适用范围广，是极具发酵潜力的酿酒酵母。虽然在N200和N400时，174y1的H2S释放量均显著高于其它菌株，但其仍属于低产H2S菌株。