鲜食葡萄品种改良岗位

　　鲜食葡萄‘香妃’和‘早玫瑰香’因为成熟期早，而且香味浓郁，适合在设施中进行促早栽培，从而提高经济效益，但是露地栽培和设施栽培条件下果实发育过程中单萜类化合物的代谢规律尚未见报道。本研究中以这两种玫瑰香型品种为试验材料，探究两种栽培条件对果实成熟过程中单萜类香气物质组成和含量的影响，为充分挖掘品种香味品质，筛选出适合该品种的最佳配套栽培方式提供依据。

　　1　试验与方法

　　1.1　试材及取样

　　试验于2014年在北京市林业果树科学研究院内进行。试验葡萄品种‘香妃’（Xiangfei），欧亚种，由北京市林业果树科学研究院育成，亲本为（玫瑰香 × 莎巴珍珠）× 绯红，为早熟绿色品种，有浓郁的玫瑰香味；‘早玫瑰香’（Zao Meiguixiang），欧亚种，也由北京市林业果树科学研究院育成，亲本为玫瑰香 × 莎巴珍珠，为早熟紫红色品种，有浓郁的玫瑰香味。‘香妃’和‘早玫瑰香’植株为4 ~ 5年生，定植在北京市林业果树科学研究院内葡萄试验地，露地，单臂篱架，倾斜式单主蔓整形，株行距为1.0m×2.5m，日光温室栽培采用单主蔓水平棚架整形，株距1.5 m，常规栽培管理。

　　果实的采集按照E-L系统的物候期（Coombe，1995）进行，E-L35、E-L 36、E-L 37、E-L 38时期分别对应于转色初期（S1，earlyveraison，果实开始转色）、成熟中期（S2，mid-ripening stage，果实Brix中间值）、转色末期（S3，end of veraison）以及成熟期（S4，berries harvest-ripe）。在转色后约每周采样一次，参考Boulton等（1995）的方法，随机选取5株树上的30个果穗，在每穗果实肩、中、顶部随机采取300粒。3次重复。

　　所有样品采集后立即用液氮速冻，置于–80 ℃超低温冰箱保存。

　　1.2　葡萄果实理化指标测定

　　随机选取60粒果实， 分成3组，分别称取质量，得到平均每粒果实质量。

　　随机选取50粒果实，用纱布包裹后通过物理挤压获得果汁，使用PAL-1型数字手持折射仪（Atago，日本）测定可溶性固形物。使用酸碱滴定法测定总酸。使用pH仪测定pH。

　　1.3　游离态香气物质提取与定性定量分析

　　葡萄果实样品香气物质的提取参考Xu等（2015）的方法，取约100 g葡萄果实，迅速除去果梗，液氮速冻，用研磨棒砸碎去籽后，加入0.5g D–葡萄糖酸内酯（抑制糖苷酶活性）和1g PVPP（去除多酚、防止样品氧化），迅速粉碎至粉末，置于50mL离心管中，在4℃冰箱中静置浸渍4h后，在4℃、8000r•min-1下离心10min，得到澄清葡萄汁用于SPME及GC–MS分析。每个品种的果实分别进行3个独立提取过程作为3个生物学重复。参照Lan等（2016）的方法，取5mL葡萄汁、1.00g氯化钠和10μL内标（4–甲基–2–戊醇，1 . 0 0 1 8 g • L -1）置于15mL样品瓶中拧紧盖子，移至加热/搅拌装置中，在40℃下加热搅拌30min，搅拌速度为500r•min-1；SPME萃取头（50/30μm DVB/Carboxen/PDMS，Supelco，Bellefonte，PA.，USA）与CTC PAL RSI85自动进样器（CTC Analytics，Zwingen，Switzerland）相连，将已活化的SPME萃取头插入样品瓶的顶空部分，继续在40 ℃下加热搅拌30 min后，取出SPME萃取头，立即插入GC进样口在250 ℃条件下解析8 min。

　　气相色谱为A g i l e n t 6 8 9 0G C ， 质谱为A g i l e n t 5 9 7 5M S （ A g i l e n t ， U S A ） 。毛细管柱为H P - I N N O WA X（60m×0.25mm×0.25μm，J & WScientific，Folsom，CA，USA）。GC–MS载气为高纯氦气（He，>99.999%），流速为1mL•min-1；进样口温度为250℃，不分流模式，解析时间8 min。柱温箱的升温程序为：50℃保持1 min，然后以3℃•min-1的速度升温至220℃，220℃保持5 min。质谱电离方式为EI，离子源温度为250℃，电离能为70eV，四级杆温度为150℃，质谱接口温度为250℃，质量扫描范围为30~350amu。每个葡萄果实样品重复检测2次。

　　利用自动化质谱图解卷积和鉴定软件（AMDIS）计算得到保留指数（RI）和质谱信息，与NIST 14标准谱库比对进行定性分析。将所有样品的GC–MS数据进行扫描，鉴定得到尽可能多的香气化合物，并建立MSL库。利用R代码将MSL库转换成Excel表格（包括化合物的名称、保留时间、保留指数、CAS号和数据文件）。

　　根据葡萄果实中糖、酸含量，配制1L含7g•L-1酒石酸和200g•L-1葡萄糖的葡萄汁模拟溶液，并用1mol•L-1氢氧化钠溶液调至pH3.4。按照葡萄果实样品中各类香气化合物的浓度水平，分别称取不同量的已有香气化合物标样用乙醇溶解，将各类香气标样溶液混合配制标准母液，连续梯度稀释15个不同浓度，建立葡萄果实香气物质标准曲线（香气化合物标样与内标化合物质4–甲基–2–戊醇的质谱选择离子扫描的峰面积比/该香气化合物标样的浓度）。对于已有标样的香气物质利用其相应的标准曲线来进行定量分析，没有标样的香气物质利用化学结构相似，碳原子数相近的标样香气物质的标准曲线进行半定量。

　　1.4　数据统计分析方法

　　折线图使用R的‘ggplot2’包绘制，层次聚类的热图使用R的‘pheatmap’包绘制，PCA分析通过MetaboAnalyst3.0完成，数据使用Auto-scaling方法进行了标准化。理化指标和单萜物质含量在两种栽培条件之间的差异利用SPSS 20.0（IBM，美国纽约）进行方差分析（Duncan’s检验，P < 0.05）。

　　2　温室和露地栽培下葡萄果实单萜积累差异

　　2.1　高含量的单萜积累差异

　　在两个品种葡萄果实发育过程中共检测到29种来源于异戊二烯代谢途径的单萜类化合物，其中里那醇的含量最高，含量较高的还有α–萜品醇、c i s 和trans–呋喃型氧化里那醇（ c i s - / t r a n sfuran linalool oxide）、β–月桂烯（β-myrcene）、柠檬烯、香叶醇和β–香茅醇等。另外，cis和trans–氧化玫瑰（cis/trans rose oxide）因具有极低的感官阈值，对果实的风味具有重大的贡献（Fenoll et al.，2009），它们在两个品种中也具有较高含量。

　　由图1可知，单萜类香气总含量在两个品种葡萄果实发育过程中均呈现升高的趋势，并且在成熟期‘香妃’高于‘早玫瑰香’，同时露地栽培的均明显高于温室栽培，里那醇含量的变化和单萜总量一致，都是呈现一直升高的趋势，并且露地的均明显高于温室栽培。cis–呋喃型氧化里那醇含量在‘香妃’果实发育过程中呈现一直升高的趋势，且露地栽培的明显高于温室栽培，‘早玫瑰香’的含量变化不大，但露地明显高于温室。trans–呋喃型氧化里那醇含量在‘香妃’露地条件下成熟时期下降，而温室栽培条件下一直升高，成熟期温室栽培的高于露地栽培；而‘早玫瑰香’的含量变化不大，但露地高于温室。

　　α–萜品醇含量在露地条件下‘香妃’果实发育前期明显高于温室栽培，但成熟期下降，而温室栽培成熟期明显升高，成熟期高于露地栽培；‘早玫瑰香’在转色末期，温室栽培的高于露地栽培。如图2可知，香叶醇含量在两种栽培条件下‘香妃’葡萄果实成熟期没有明显差异，而在‘早玫瑰香’果实成熟期露地栽培高于温室栽培。

　　两种葡萄果实发育过程中β–月桂烯、柠檬烯、cis–氧化玫瑰和trans–氧化玫瑰含量的变化和单萜总量基本一致，都是呈现一直升高的趋势，并且均为露地高于温室，特别是cis–氧化玫瑰含量在温室栽培下几乎检测不到。

　　2.2　主成分分析（PCA）和聚类热图分析

　　为了比较温室和露地栽培条件下的总体差异，对两种葡萄果实不同发育阶段单萜的含量和理化指标进行主成分分析。主成分1和主成分2的贡献率分别为54.9%和21.5%（图3）。从图3中可以看出‘早玫瑰香’温室和露地栽培下的葡萄可以很好地区分开，露地栽培趋于PC1的正半轴，温室栽培趋于PC1的负半轴；‘香妃’葡萄有一定的重叠，主要是由于温室栽培下成熟期与露地栽培的较为接近，但是总体上露地栽培趋于PC1的正半轴，温室栽培趋于PC1的负半轴。

　　从主成分载荷图（图4）可以看出，大部分单萜化合物都位于PC1的正半轴，其中贡献较大的包括柠檬烯、(Z)–别罗勒烯[(Z)-alloocimene]、(E,Z)–别罗勒烯[(E,Z)-allo-ocimene]、里那醇、β–月桂烯、异松油烯（terpinolen）、(Z)–β–罗勒烯[(Z)-β-ocimene]、cis和trans–氧化玫瑰、β–香茅醇和cis–吡喃型氧化里那醇（cis-pyranlinalool oxide），这些单萜化合物含量的差异可以在一定程度上解释温室和露地栽培的差异。同时，这也进一步说明两个葡萄品种在露地栽培条件下单萜含量更加丰富，两种栽培条件下的‘早玫瑰香’单萜含量差异更明显，‘香妃’成熟期接近，并且高于‘早玫瑰香’。为了进一步区分两种葡萄果实在温室和露地栽培条件下单萜化合物的差异，运用层次聚类的热图展示所有单萜化合物在葡萄果实发育过程中的变化。如图5所示，单萜类香气物质均可以聚成三大类。

　　在‘ 香妃’ 葡萄中， 第1 类单萜化合物表现出在果实发育前期含量较高，之后下降，在成熟时升高的趋势， 并且它们在露地和温室栽培条件下成熟期含量差异不明显， 这类香气成分包括桃金娘烯醇（myrtenol）、薄荷醇（ m e n t h o l ） 、香茅醛（ c i t r o n e l l a l ） 、橙花醛（neral）、香叶醛（geranial）、β – 香茅醇、香叶醇、异香叶醇（i sogeraniol）、γ–香叶醇（γ-geraniol）、橙花醇（nerol）和香叶酸（geranic acid）；第2类表现出两种栽培条件下在果实发育过程中均呈升高的趋势，并且成熟期露地明显高于温室，包括异松油烯、柠檬烯、(Z)–别罗勒烯、里那醇、cis–呋喃型氧化里那醇、cis–吡喃型氧化里那醇、cis–氧化玫瑰、(E,Z)–别罗勒烯、β–月桂烯、(E)–β–罗勒烯[（E）-β-ocimene）]、(Z)–β–罗勒烯、γ–松油烯（γ-Terpinen）和樟脑（camphor）等；这些单萜化合物大部分对应于主成分分析筛选得到的差异贡献大的物质，可以在一定程度上解释‘香妃’葡萄中温室和露地栽培的单萜含量差异。第3类表现在露地栽培条件下果实发育前期先升高，成熟时下降，而在温室栽培条件下一直升高，因而在成熟期温室栽培的高于露地栽培，包括trans–呋喃型氧化里那醇、橙花醚（nerol oxide）、α–萜品醇和4–松油烯醇（4-terpineol）等。

　　在‘早玫瑰香’葡萄中，所有单萜类香气物质也聚成三大类。第1类体现为两种栽培条件下在果实成熟期含量升高，并且温室栽培的高于露地栽培，这与‘香妃’葡萄中第3类较为相似，包括异香叶醇、α–萜品醇、4–松油烯醇、桃金娘烯醇、薄荷醇和香茅醛，其中α–萜品醇和4–松油烯醇也存在于‘香妃’葡萄中第3类。第2类体现为露地栽培条件下明显高于温室栽培，且果实发育过程中含量变化不大，包括trans–吡喃型氧化里那醇、橙花醚、β–香茅醇、γ–松油烯和樟脑。第3类表现出在两种栽培条件下果实发育过程中呈升高的趋势，并且露地栽培条件下成熟期明显高于温室栽培，这类与‘香妃’葡萄中第2类较为相似，包括橙花醛、香叶醛、里那醇、香叶醇、γ–香叶醇、橙花醇和香叶酸。cis–呋喃型氧化里那醇、cis–吡喃型氧化里那醇、cis–氧化玫瑰、trans–氧化玫瑰、(E,Z)–别罗勒烯、(Z)–别罗勒烯、β–月桂烯、(E)–β–罗勒烯、(Z)–β–罗勒烯、异松油烯、和柠檬烯，这些物质大部分存在于‘香妃’葡萄中第1、2类。