济南综合试验站
尹向田 宫磊 王咏梅 陈迎春
生物防治是利用有益的生物或其代谢产物防治有害生物的方法，对人畜安全、对环境和果品没有污染，对有害生物不产生抗性，是最安全的防治策略。有益微生物是生物防治的重要来源，其中，芽孢杆菌以其繁殖速度快、抗逆性强等优势逐渐成为葡萄病害生物防治的热点。虽然国内外学者对生防芽孢杆菌进行了大量研究，但是在葡萄病害中，尤其是葡萄白腐病的防治方面，生防芽孢杆菌的研究相对较少，筛选到具有高效拮抗活性的芽孢杆菌是研发生防制剂，实现生物防治的关键环节。本研究从葡萄种植园根际土壤中分离筛选到一株对葡萄病原菌有较好防效的芽孢杆菌GSBM05，对菌株GSBM05初的抑菌活性进行了初步探索，并对该菌株进行了鉴定。本研究通过对葡萄根际土壤微生物的定向筛选，预获得高效拮抗葡萄病原菌的芽孢杆菌，为葡萄病害的生物防治提供基础材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)于山东省葡萄研究院良种与栽培研究室保存。
1.1.2 培养基
NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨8 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.2；PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L。NB培养基：不加琼脂的NA培养基，用于菌株种子液培养；PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20g，水1000 mL，用于真菌培养及抑菌试验。1.1.3 供试药剂 10%世高水分散粒剂，先正达生物科技有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 菌株GSBM05无菌发酵液对
葡萄白腐病菌的抑制作用采用菌丝生长速率法测定发酵液对葡萄白腐病菌的抑制作用。将发酵液与培养基混合，使滤液分别稀释20、50、100、150倍，加入等体积的无菌培养液的PDA培养基为对照，每处理3个重复，28℃培养3天内后，计算菌丝生长抑制率，之后挑取处理及对照的病原菌菌丝，在光学显微镜下观察无菌发酵液对菌丝形态的影响并进行拍照。
1.2.2 菌株GSBM05对葡萄白腐病的防治作用
选取外观整齐、无病虫害、无外伤的果实，先用自来水冲洗干净，然后用75%酒精喷洒消毒，2min后用无菌滤纸擦干。将果实放入铺有无菌滤纸的直径为100 mm的培养皿中，加入无菌水保湿，每个处理叶片和果实各8个，重复3次。取葡萄白腐病菌的孢子悬浮液分别与菌株GSBM05发酵液、无菌发酵液、菌悬液、10%世高2000倍和无菌水液等体积加入到离心管中混匀，用消毒接种针在每个果实上刺伤一个1 mm左右的伤口，在伤口处分别接种50 μL接种液，28℃保湿培养，每天进行病害统计并计算防治效果。病害分级采用唐芳等方法，病情指数计算参照方中达的方法。
防效=[(无菌水对照的病情指数-处理的病情指数)/无菌水对照的病情指数]×100%
1.2.3 菌株GSBM05菌体及无菌发酵液抑菌谱的测定
菌体采用对峙培养法，无菌发酵液采用菌丝生长速率法，无菌发酵液与PDA混合稀释10倍测定其对11种供试病原菌的抑制作用，计算抑菌率。
3 结果与分析
3.1 对菌丝生长的影响
菌株GSBM05无菌发酵液对葡萄白腐病菌菌丝生长具有明显的抑制作用，无菌发酵液稀释20倍对菌丝的抑制率为96.8%，稀释50倍抑制率仍接近80%，随着无菌发酵液稀释倍数的增加，抑制率逐渐下降，但稀释100倍和150倍对菌丝的生长抑制率仍能达到62.1%和51.7%。光学显微镜下观察，被GSBM05菌株抑制的葡萄白腐病菌菌落边缘菌丝的形态发生了显著的变化。菌丝的生长出现畸形，菌丝变粗，弯曲，分枝处较为膨大，分枝变多。菌丝顶多膨大成球形，部分菌丝内原生质流出形成空壳。对照菌丝生长细长且均匀，无畸形现象（图1）。
3.2 菌株GSBM05对葡萄白腐病的防治作用
菌株GSBM05离体葡萄果实结果表1表明：在第二天时，未施药的果实全部发病，施药后接种病原菌的4个处理中，发酵液的防治效果最好，在第五天时果实病斑开始出现，对果实防效为94.4%。发酵液和世高2000倍液防效之间无显著差异，无菌发酵液及菌悬液的防治效果低于发酵液，但也均在85%以上。可见，施用发酵液的效果要比单独施用无菌发酵液和菌悬液效果好。
2.4 菌株GSBM05抑菌谱的测定
测定结果表明，菌株GSBM05活体及稀释10倍后的无菌发酵液对11种供试植物病原真菌具有不同的抑菌活性（表2）。菌株GSBM05活体对葡萄白腐病菌、杨树水泡溃疡病菌、杨树腐烂病菌的抑制率均在75%以上，对其他病原菌的抑制率在50.2%~72.6%之间。菌株GSBM05无菌发酵液对葡萄白腐病菌和杨树腐烂病菌抑制效果最好，抑菌率为100%。其次对杨树水泡溃疡病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄蔓枯病菌、立枯丝核菌及尖镰刀病菌的抑制率均在70%以上，对葡萄炭疽病菌和葡萄枝枯病菌的抑制作用相对较差，均低于50%。结果表明菌株GSBM05抗菌谱较广，抑菌活性较强。
4 讨论
在土壤中，芽孢杆菌是一种普遍的微生物，有益的芽孢杆菌不但能够抑制和杀灭病原菌，还能促进植物生长。充分利用这些微生物的生物学潜力将有助于减少化肥和农药使用、促进植物生长，实现农业可持续发展。本研究采用定向分离的方法从健康葡萄根际土壤中分离到一株芽孢杆菌GSBM05，初步实验表明，菌株GSBM05的活体及无菌发酵液能够强烈抑制孢子萌发和菌丝生长，并导致了菌丝畸形。表明该菌株在发酵过程中产生了抑菌活性物质。芽孢杆菌通过分泌一些酶类、多肽类抗生素、细菌素等次生代谢产物抑制病原菌的生长，其产生的抗菌活性物质是防病的主要机制。而对于本试验中发酵产物有效活性成分以及拮抗机理还有待进一步研究。
本研究发现，该菌株对供试的11种植物病原真菌有良好的抑制作用，尤其对葡萄白腐病菌、杨树腐烂病菌的菌丝生长抑制率均为100%，认为菌株GSBM05具有光谱抗植物病原真菌活性，在生物防治中具有较高的利用价值。菌株GSBM05的菌体及发酵产物对离体葡萄果实表现出了较好的防效，发酵液对葡萄离体果实的防治效果分别为94.4%。同10%世高水分散粒剂相比并没有明显差别，因此可将其活体菌株或者发酵产物制成菌剂，为将来葡萄病害生防菌剂的研发奠定基础。