中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心

范旭东 董雅凤 张尊平 胡国君 任芳

　　葡萄卷叶相关病毒1 3（Grapevine leafroll-associated virus 13,GLRaV-13）是2016年日本报道的一个新的病毒，基因组全长17,608nt，包含11个开放阅读框，根据其基因组结构及聚类分析，建议将该病毒划分为葡萄卷叶病毒属（A m p e l o v i r u s）的一个新成员。GLRaV-13起初从一个表现葡萄卷叶病的葡萄样品中（代号为a177）获得的，但由于该样品同时携带葡萄卷叶病毒3（Gr a p e vi ne le af ro llasso ci at e d vi r u s 3, GLRaV-3），因此，尚不能确定GLRaV-13的致病性。本研究采用小RNA测序技术对表现褪绿斑驳的左山二葡萄进行深测序，在中国首次发现了GLRaV-13。同时，通过RT-PCR方法进行了GLRaV-13扩增，并对扩增产物进行克隆测序，从而证实了GLRaV-13的存在。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　用于小RNA测序的葡萄样品为左山二，该样品春季表现明显的系统性褪绿斑驳症，种植在中国农科院果树研究所国家落叶果树中心试材保存圃（辽宁兴城）。春季，采集该葡萄叶片样品用液氮速冻后，于-80℃超低温冰箱保存待用。

　　1.2　小RNA测序及分析

　　将表现症状的葡萄叶片通过干冰运输至北京百迈克生物科技有限公司，委托其对叶片中的小RNA进行深测序。原始数据过滤、小RNA组装及Blast比对按照之前报道的方法进行。

　　1.3　RNA提取及反转录

　　RNA提取参照范旭东等人（2014）报道的吸附柱提取方法。反转录在1.5mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水7.0μL、6bp随机引物（50μmol•L-1）（上海生工生物工程技术服务公司合成）1.0μL，总RNA2.0μL，离心混匀，95℃ 水浴5min， 冰上放置2min；加入5×M-MLV buffer5.0μL、10mmol•L-1dNTPs 1.5μL、2 0 0 U • m L - 1 M-MLV逆转录酶0.8μL、灭菌纯水2.7μL，37℃水浴10min，42℃ 50min，70℃ 5min。合成的cDNA立即进行PCR扩增或者放-20℃冰箱保存。

　　1.4　PCR扩增

　　根据小R N A 拼接获得的GLRaV-13序列设计两对引物（表1），分别用于扩增GLRaV-13的CP和HSP70h基因序列。PCR反应体系为25μL，含10×Taq DNA聚合酶缓冲液 2.5μL、10mmol/L dNTPs0.5μL、10mmol/L引物各0.5μL、5U/mL Taq酶0.5μL、模板cDNA2.5μL、灭菌纯水18μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5min；95 ℃ 40sec，55℃ 40 sec，72℃ 50 sec（CP基因）或1min20 sec（HSP70h基因），循环35次；72℃ 7min；4℃终止反应。

　　1.5　克隆测序及序列分析

　　PCR产物采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收纯化。取4μL纯化 的DNA与零背景TOPO TA克隆试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）中的 10×Enhancer buffer0.5μL和pTOPO-T载体 0.5μL混匀后，室温连接5 min后，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5ɑ感受态细胞，均匀涂布于含氨苄青霉素的LB培养皿上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落进行菌液培养，并通过PCR鉴定获得阳性的重组质粒，每个分离物至少选3个阳性的重组质粒送北京诺赛基因组研究中心进行测序。采用DNAstar软件对测序结果进行核苷酸和氨基酸同源性比对。

　　2　结果分析

　　2.1　小RNA测序

　　原始数据和过滤后数据（Cleandata）中的小RNA数分别为23，392，877和17，882，782。通过对Clean data中小RNA进行拼接，并与病毒类病毒数据库进行Blast比对，结果显示样品中存在GLRaV-13的基因序列，未发现其他病毒的特异性序列。拼接获得的GLRaV-13序列共112条，对应GLRaV-13分离物a177 (GenBank登录号：NC_029783)基因组的覆盖率为64.9%（11420/17608），同源性为87.50%～100%。

　　2.2　GLRaV-13的PCR鉴定

　　采用引物GL13CP13528-1a/1b和GL13HSP10663-1a/1b分别对上述测序样品中的GLRaV-13进行RTPCR扩增，分别获得长度为597bp和1204bp的目的片段（Fig.1）。对目的片段进行回收、克隆及测序，结果表明获得的CP基因序列与已报道GLRaV-13分离物a177的核苷酸和氨基酸同源性分别为96%和100%，HSP70h基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95%和99%。获得序列的GenBank登录号分别为MH347901和MH347905。