生物防治与综合防控岗位

孔繁芳 王忠跃

　　葡萄霜霉病（Downy mildew）是由葡萄霜霉菌[ Pl asmopar a vi t ic ola （Berk. dt Curtis）Berl. Et de Toni]引起，生物隶属卵菌门，卵菌纲，霜霉目，霜霉科，单轴霉属。该病原菌为二倍体活体营养型的专性寄生真菌，是危害最为严重且影响最为广泛的病害之一，是一种古老的世界性真菌病害，分布于世界上所有种植葡萄的国家和地区，严重影响着葡萄的产量和品质，严重的年份可减产70%-80%。

　　萄霜霉菌为专性寄生菌，无法在合成培养基上培养，只能从活体的寄主组织中获取养分进行生长，该病害潜育一般为4-12d，主要受寄主抗性及环境条件的影响，且在室内培养条件下不易对菌原菌进行大量繁殖，培养难度大，这一度成为制约该病菌研究的障碍。因此研发一种室内快速纯化与扩繁方法研究该病菌的遗传多样性、抗药性及防控技术具有重大意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　扩繁材料

　　葡萄霜霉菌、感病葡萄品种的叶片

　　1.2　主要试剂及设备

　　琼脂粉、灭菌水、次氯酸钠溶液、75 %乙醇、超净工作台，光照培养箱，解剖镜，生物专用直头镊子，显微镜、打孔器（直径为15 mm）高压蒸汽灭菌锅，分析天平、培养皿直径为（90 mm）、移液器及其他辅助设备。

　　1.3　方法

　　采用叶碟法进行，具体操作步骤如下：

　　（1）配制浓度为1 %的水琼脂培养基：称取5 g琼脂粉倒入锥形瓶中，加入去离子水定容至500 ml，封口，高压蒸汽灭菌锅121 ℃下，灭菌30 min，备用；

　　（2）在培养皿中加入灭菌的1%的水琼脂，得到叶片保湿培养装置 ；

　　（3）选取对霜霉病菌敏感的葡萄品种，采集葡萄一年生新梢自上而下的第 3-5 片叶片，首先对采集的叶片进行镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，清洗干净叶表面的灰尘，然后进行消毒处理 ；

　　（4）将消毒处理后的葡萄叶片用直径 2-2.5 cm的打孔器从叶片中部打取叶圆片，将叶圆片背面向上平摆在所制备的保湿培养皿，每个圆叶碟上滴10-20μl灭菌的蒸馏水；

　　（5）将葡萄霜霉病菌孢子囊制备成葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液，将悬浮液均匀涂布在水琼脂平板上，将涂孢子囊的平板切成2 mm×2 mm的琼脂块，在显微镜下将含单孢子囊的琼脂块倒扣到叶盘上来促使侵染，分别置于温度为 16-25℃，湿度：70%-95%，光照时间：8-16h/天，光照强度20-60μmol m-2s-1的条件培养4-7天，后观察其生长情况。

　　2　结果分析

　　通过置于不同条件的培养，发现在温度22℃，光照周期 16 h 白天/8h 黑夜，光照强度40 Lux最适合葡萄霜霉菌的生长（图1）。截止目前，本团队按照上述扩繁方法对葡萄霜霉病菌进行传代培养到第60代。