葡萄育种方法与技术团队

宋士任 陈淑云 卢江

　　1　前言

　　由葡萄霜霉菌引起的葡萄霜霉病（downy mildew）是葡萄上最具毁灭性的病害之一，严重影响葡萄的产量和质量。葡萄霜霉菌（Pl asmo pa r a viti co l a（Berk. andCurt.）Berl. and de Toni），是一种严格的活体营养专性寄生的植物病原卵菌（Hermann, 2008）。探究霜霉菌的致病机理和葡萄的抗性机制对于葡萄抗霜霉病的防控及分子育种具有重要意义。

　　植物病原菌卵菌在侵染过程中分泌大量效应蛋白，调控寄主的各种生理生化过程，帮助自身增殖。随着大量植物病原菌基因组测序的完成，大量的RXLR类效应蛋白从基因组中被预测。

　　效应蛋白RXLR类效应蛋白是卵菌抑制寄主免疫反应的重要武器，通过攻击靶蛋白在抑制PTI和ETI反应中发挥的作用。卵菌利用RXLR类效应蛋白通过攻击靶蛋白抑制寄主免疫反应的分子机制研究的相关报道主要集中在马铃薯疫霉菌、大豆疫霉菌和拟南芥霜霉菌，在葡萄霜霉菌中的相关报道较少。

　　HY5是一个bZIP转录因子，与其高度同源的蛋白HYH，以同源二聚体（homodimers）或异源二聚体（heterodimers）的形式，调控靶基因的转录，在植物光形态建成中发挥重要的作用。CHIP-chip全基因组分析结果显示，受HY5调控的靶基因参与生长素信号通路、赤霉素信号通路和乙烯信号通路等，这表明HY5既参与光信号诱导的基因转录调控又参与植物激素信号通路相关基因的转录调控，从而整合了光信号途径和植物激素的信号传递途径。活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）参与生长发育、生物胁迫响应、非生物胁迫响应和细胞程序性死亡等多种信号通路，然而过高的ROS将导致光氧化损伤，抑制光合作用。PIF1/PIF3-HY5/HYH在不同光强下调控ROS的相关基因的表达，将光信号途径和ROS信号传递途径联系在一起，使得植物能够适应环境中不同的光强度。

　　因此HY5在光形态发生以及植物应答非生物胁迫方面扮演了重要的角色，但到目前为止，并没有发现HY5直接响应病原菌等生物胁迫的相关报道。

　　2　方法与结果

　　2.1　HY5是拟南芥抗霜霉病的正调控因子

　　将拟南芥霜霉菌H p a （ 浓度调至5×104spores/ml）分别接种于10-d-old的野生型Col-0，突变体h y 5 ， h y h ， h y 5 hyh以及异源表达Ha R X L R 5的拟南芥转基因植株，3天后，用显微镜观察不同处理的拟南芥霜霉菌的生长情况。实验结果表明，突变体h y 5以及异源表达HaRXLR5的拟南芥转基因植株叶片上的孢子数明显多于野生型Col-0。这表明，HY5在拟南芥抗霜霉病中起正向调控的作用（图1）。

　　2.2　葡萄霜霉菌效应蛋PvRXLR13定位于细胞质和细胞核并能够抑制BAX及INF1引起的PCD

　　利用农杆菌介导的遗传转化，在烟草叶片细胞内瞬时表达融合蛋白PvRXLR13-GFP，并检测融合蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位。荧光显微镜观察结果显示PvRXLR13定位在细胞质和细胞核（图2A）。INF1、BAX在烟草叶片上引起的细胞程序性死亡（PCD）是非常强烈的植物免疫反应。为了明确葡萄霜霉菌效应蛋白PvRXLR13是否可以抑制植物先天免疫，我们通过构建植物表达载体，利用农杆菌介导遗传转化，在烟草叶片中瞬时表达PvRXLR13，24 h后再注射农杆菌菌液，在烟草叶片中瞬时表达激发子INF1、细胞凋亡诱导因子BAX。结果表明PvRXLR13可以抑制由BAX和INF1引起的PCD（图2B和图2C）。

　　2.3　葡萄霜霉菌效应蛋PvRXLR13与VvHY5在体外相互作用

　　利用酵母双杂交系统检验PvRXLR13和靶蛋白之间是否存在直接的相互作用。实验结果表明在酵母体系中，葡萄霜霉菌效应蛋白PvRXLR13分别和VvHY5及其同源蛋白VvHYH相互作用（图3A）。为了进一步验证目的蛋白之间的相互作用，分别原核表达融合蛋白VvHY5-6×His，VvHYH-6×His和GST-PvRXLR13，进行Pull Down实验。Western Blot检测证实了PvRXLR13分别和VvHY5及VvHYH相互作用（图3B）。

　　2.4　HaRXLR5与AtHY5在体外相互作用

　　葡萄作为多年生果实作物，在开展某些分子实验如转基因/基因敲除/功能验证实验中有一定的局限性，为后续蛋白质互作机制的深入解析带了不便。因为我们的研究发现PvRXLR13在卵菌中保守，其中与拟南芥霜霉菌效应蛋白HaRXLR5在氨基酸序列相似性高达69.41%（图4）。以拟南芥这一模式植物作为研究对象，深入探究拟南芥霜霉菌效应蛋白HaRXLR5与HY5之间的相互作用及互作机制，从而加深我们对于PvRXLR13与VvHY5的互作机制的理解，为葡萄抗霜霉病分子育种提供新的策略。为了检测HaRXLR5与AtHY5及AtHYH之间是否存在相互作用，我们分别原核表达融合蛋白AtHY5-6×His，AtHYH-6×His和GSTHaRXLR5，进行Pull Down实验。

Western Blot检测表明HaRXLR5与AtHY5及AtHYH之间的确是相互作用的（图5）。

　　3　结论与展望

　　通过研究发现葡萄霜霉菌效应蛋白PvRXLR13在霜霉菌侵染早期被强烈诱导，定位在细胞核和细胞质。PvRXLR13在大多数卵菌中较为保守，其中与拟南芥霜霉菌效应蛋白HaRXLR5的相似性最高，其氨基酸序列相似性高达69.41%。酵母双杂交及pull down实验表明葡萄霜霉菌效应蛋白PvRXLR13与寄主葡萄的bZIP 转录因子VvHY5相互作用；拟南芥霜霉菌效应蛋白HaRXLR5分别与拟南芥AtHY5相互作用。由此可见植物bZIP转录因子HY5是PvRXLR13和HaRXLR5这一类在卵菌中保守的效应蛋白的靶蛋白，这暗示着HY5在植物响应卵菌这一生物胁迫过程中发挥着重要功能。

　　鉴于HYH与HY5高度同源且存在功能冗余，下一步的研究可以从葡萄霜霉菌效应蛋白PvRXLR13入手，在生物化学、分子生物学、细胞生物学等不同层面深入研究效应蛋白PvRXLR13与VvHY5的相互作用，借助拟南芥霜霉菌效应蛋白HaRXLR5与AtHY5的相互作用深度探究其互作分子机制，探究这一类在卵菌中保守的效应蛋白在植物中阻断植物先天免疫的分子机制，明晰HY5在抗霜霉病中的功能及作用机制。有利于深入阐明HY5在植物应答生物胁迫中所发挥的重要功能，为葡萄抗霜霉病乃至其它作物抗卵菌病害的分子育种提供理论依据和新的防控策略。