酿酒微生物岗位

刘延琳团队

　　摘　要：分析了赤霞珠、霞多丽、雷司令3个酿酒葡萄上主要的产毒微生物的种类及其产生的毒素种类，污染的霉菌主要有曲霉、青霉、毛霉、根霉、链格孢属、枝孢属、镰刀菌属；从赤霞珠上分离到的OTA产生菌主要是黑曲霉、炭黑曲霉和一株枝状枝孢菌。分离到的两株黄曲霉毒素产生菌主要是产黄曲霉和寄生曲霉。研究了炭黑曲霉、黑曲霉和其它两种新发现的毒素产生菌等主要产毒微生物的生长条件与产毒条件。

　　引　言

　　近年来，有关葡萄酒中污染赫曲霉毒素的报道屡见不鲜，如何控制与防止葡萄酒中赫曲霉毒素污染已经逐渐引起人们的重视。酒中真菌毒素主要来源于葡萄原料上毒素产生菌的污染与产毒。据国外报道，葡萄上的赫曲霉素产生菌主要是黑色曲霉类，多来源于田间污染。刚开始时，其污染多限于葡萄表面，致葡萄有伤后才会进入葡萄内部。国内有关酿酒葡萄上的毒素产生菌方面的研究尚未见报道。为了了解与掌握国产酿酒葡萄表面的毒素产生菌种类及其所产毒素，本研究主要赤霞珠、霞多丽、雷司令3个酿酒葡萄上主要的产毒微生物的种类及其产生的毒素种类。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　葡萄采集

　　按照十字交叉法，在葡萄园的对角线和中心位置取健康和腐烂的葡萄样品。具体采样地点、葡萄品种和采样量如表1所示；葡萄园中空气的采样地点如表2所示。

　　1.1.2　主要试剂与仪器

　　赭曲霉毒素A，FERMENTEK公司；展青霉素、黄曲霉毒素，Sigma公司；甲醇（色谱纯）Sigma公司；乙腈（色谱纯）Sigma公司。ZF-6型三用紫外分析仪；日本岛津LC-2010A高效液相色谱仪；黄曲霉毒素B1检测试纸条，检测线5μg/L。

　　1.1.3　培养基

　　DRBC培养基， 每1 L 中含葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4•H2O 0.5g，孟加拉红25mg， 氯硝胺2mg， 氯霉素100mg，琼脂15g；可可浆培养基：50%可可浆，1.5%琼脂。PDA培养基，添加氯霉素，具体参照GB4789.15-2010《食品卫生微生物学检验-霉菌和酵母计数》。

　　1.2　方法

　　1.2.1　产赭曲霉毒素A的微生物的紫外荧光筛选法

　　将所有菌株接种于PDA培养基上培养5-7天后，以单点或多点接种法将除黑曲霉以外的其它菌株转接到CA培养基上，25 ℃避光培养14天；将黑曲霉转接到CCA培养基上，25 ℃避光培养7天。培养结束后，用波长为365nm的紫外灯照射平板，观察平板背面的荧光产生情况。以不接种的相应平板作为对比，筛选出能够产生绿色、黄绿色荧光（CA培养基）和蓝绿色荧光（CCA培养基）的平板；再用25-28%的氨水避光熏蒸1h，挑选在紫外灯下荧光增强的菌株即为有可能产生OTA毒素的菌株。

　　1.2.2　赭曲霉毒素A的液相检测法

　　参照Bragulat等的方法，将菌种在CCA或CA培养基上培养7天或14天后，用打孔器打取3块培养物（培养基带菌体，直径4.6mm）放于4ml小试管中，称量后加入甲醇500μl，漩涡震荡1min，静止提取60min后，用0.45μm滤膜过滤，用HPLC进行检测。

　　H P L C 检测条件： 采用日本岛津高效液相色谱仪L C -2010A，包括荧光检测系统和自动进样系统。荧光检测器检测波长：激发波长330nm，发射波长460nm；色谱柱： 反相C18柱，250mm×4.6mm，5μm； 柱温：30℃； 流动相为乙腈：水：乙酸=99：99：2； 流速：1.0ml/min；进样量：20μl。根据检测的毒素含量和所取琼脂块的重量计算每克培养物中的毒素浓度，表示为毒素产量（ng/g）。

　　1.2.3　展青霉素和黄曲霉毒素B1检测方法

　　展青霉素采用国家标准SN/T2008-2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法-高效液相色谱法》方法进行检测，黄曲霉毒素B1采用试纸条法进行定性检测，检测线为5μg/kg。

　　1.2.4　菌种分类鉴定

　　菌种鉴定主要依据形态特征，根据菌落的形态和菌丝的特征对分离得到的菌株进行鉴定。具体鉴定方法参照Pitt and Hocking。

　　2　结果与分析

　　2.1　不同葡萄品种上霉菌污染总量

　　由表3可以看出，在所有的葡萄品种中，无核白上的霉菌污染总量最多，其它两种鲜食葡萄品种（巨峰和红地球）的霉菌污染量则远远小于其它葡萄品种；在酿酒葡萄品种中，梅尔诺和霞多丽表面的真菌污染量稍高于其它葡萄品种。对于所有葡萄品种而言，损伤葡萄表面的霉菌污染量均大于健康葡萄，其中以无核白在两者间的差异最大。这说明，无核白在损伤后极易遭受霉菌的污染，因此在贮藏过程中保证其果实的完整性对于其防腐非常重要。由DRBC培养基和PDA培养基分析所得霉菌污染总数的结果虽然在绝对值上有所差异，但两种方法在评价不同葡萄品种的相对污染量方面无显著差异。

　　对葡萄表面污染的霉菌进行初步分析发现（表4），各种葡萄上不同霉菌污染量从高到低依次为：黑曲霉、毛霉、青霉、镰刀菌、链格孢属、枝孢属、黑色根霉。用PDA和DRBC培养基获得的检测结果在绝对数值上有所差异，但其在评价各种霉菌污染量的相对大小方面的分析结果基本一致由于霉菌在PDA上的菌落扩展速度较快，很容易覆盖住整个平板，从而导致计数有所偏差，而DRBC培养基中加有抑制菌落扩展的试剂，霉菌菌落在其上的扩展速度较慢，易于计数。因此，推荐用DRBC培养基来评价霉菌污染量。

　　结合采样地区葡萄园空气中的真菌污染量分析结果（表5）可以看出，葡萄园空气中真菌污染量对该葡萄园中所采葡萄表面的真菌污染量有一定影响，但有些对真菌污染耐受力比较强的葡萄品种对抵抗真菌污染的能力也比较强。例如，就葡萄园的空气质量而言，渭南和西安采样点的空气质量最差，特别是青霉污染量较大，而采自这两个地区的两个鲜食葡萄品种（红地球和巨峰）即使在受损葡萄上的真菌污染量也比较低。这说明，这两个葡萄品种具有很强的抗真菌污染能力。与其相比，鲜食葡萄品种无核白的葡萄园中真菌污染量很低，但健康葡萄和损伤葡萄表面的真菌污染量却较高，特别是损伤葡萄上污染量特别高。这说明，无核白的抗霉菌污染能力很差。

　　对比表4和表5可以看出，不同地区、不同葡萄品种上各种霉菌的污染量有所差异。如，同为杨凌曹新庄地区，葡萄园地点也相距很近，但黑比诺葡萄园空气中真菌污染量较高于霞多丽葡萄园，健康的黑比诺表面真菌污染量也稍高于霞多丽，但损伤的霞多丽中真菌污染量稍高于黑比诺。这说明，黑比诺对真菌的抗污染能力高于霞多丽；健康葡萄表面的真菌污染量与空气中真菌污染量的相关性大于损伤葡萄。

　　2.2　不同葡萄品种上污染的霉菌种类

　　由表6可以看出，在各个葡萄品种中，污染的霉菌均以毛霉最多，其次有曲霉、青霉、根霉、链格孢属、枝孢属、镰刀菌等。表5显示，不同葡萄品种上污染的各类霉菌的数量不同，一般菌种在健康葡萄上的污染量均远远小于损伤的葡萄；而链格孢属虽然在大多数健康葡萄上虽然有，但在损伤的葡萄中却很少有，或者根本就没有；根霉在三种鲜食葡萄和杨凌采的赤霞珠葡萄中的污染量均很少，而在其它酿酒葡萄品种中污染量较大；枝孢属在损伤的无核白和霞多丽及健康的白雷司令中没有检到，镰刀菌在鲜食葡萄品种上的污染量普遍大于酿酒葡萄（除梅尔诺较多外）。对于空气中污染的真菌种类，葡萄上污染的真菌种类的数量与葡萄园中污染的各类霉菌的污染量基本一致。这说明，葡萄上的污染的霉菌种类与其葡萄园空气中真菌污染有很大关系。

　　2.3　葡萄上毒素产生菌的污染量

　　表7是从不同葡萄品种上分离到的能够产生真菌毒素的霉菌种类及其污染量。由表7可以看出，在鲜食葡萄品种中，除红地球健康果实表面上产毒菌污染量大于损伤果实以外，其它两个葡萄品种（巨峰和无核白）健康果实表面的产毒菌的污染量均远远小于损伤葡萄。在酿酒葡萄品种中，除白雷司令的损伤果实上的产毒菌污染量高于健康果实以外，其它葡萄品种健康果实上的产毒菌污染量均高于损伤果实。这说明不同葡萄品种果实的化学组成可能对产毒菌的生长有一定的影响。大多数酿酒葡萄和红地球葡萄果实的化学组成分不利于产毒菌的生长，而巨峰、无核白和白雷司令果实中的化学组成则有利于产毒菌的生长。

　　此外，除了在巨峰和梅尔诺中没有分离到黄曲霉毒素产生菌以外，在其它葡萄品种中均分离到了赭曲霉毒素、展青霉素和黄曲霉毒素的产生菌。这意味着，大多数葡萄品种会有受到这些毒素污染的潜力在危害。从产毒菌的数量来看，大多数葡萄品种中污染OTA产生菌和PAT产生菌的量较大，而污染黄曲霉毒素产生菌的数量较少。不同葡萄品种上各种产毒菌的污染数量会有一定差异，这可能跟空气这些霉菌的污染量有关。

　　2.4　葡萄上毒素产生菌的种类及其毒素产生能力

　　表8展示的是从所有葡萄品种上分离到的毒素产生菌的种类及其在固体培养或液体培养中的毒素产生能力。由表8可以看出，共分离到OTA产生菌16株，其中12株为曲霉，而且9株为黑色曲霉，只有3株为其它曲霉属；分离到PAT产生菌17株，其中13株为青霉，只有4株为曲霉；分离到黄曲霉毒素B1产生菌3株，均为曲霉，其中2株为黄曲霉，1株为寄生曲霉。

　　分离到的产毒菌株中，其毒素产生能力并不相同，其中OTA产生量最大的可以达到13179 ng/g，而产量最小的只有3.93ng/g；即使是同一属的微生物，不同菌株间毒素产量也有很大差异。总体来讲，炭黑曲霉的OTA产生量最大，其次为青霉中的疣孢青霉。

　　3　结论

　　通过对葡萄表面上的真菌污染量及其毒素产生能力的分析，结果发现，不同葡萄品种上污染的真菌总数和真菌类型均有所差异；葡萄表面污染有能够产生赭曲霉毒素、展青霉素和黄曲霉毒素的霉菌，个别菌株的毒素产量很高，从而揭示葡萄及其制品中存在于毒素污染的潜在危害。