制汁葡萄品种改良岗位
郭印山 高宏艳 苏凯 刘镇东 李坤 李成祥 马海峰 郭修武
白腐病是葡萄主要病害之一，是由白腐病原菌（Coniothyriumdiplodiella（Speq.）Sacc）引起的。郭京南等（2010）在《葡萄种质资源描述规范和数据标准》概述及使用讨论中指出，葡萄病害评价与鉴定受到自然因素的影响较大，并没有统一的标准。因此，可靠、稳定、可重复性强的白腐病抗性评价系统对葡萄白腐病抗性鉴定及分析显得尤为重要。关于葡萄白腐病抗性遗传的研究，康俊生和贺普超（2003）对起源于我国的葡萄属野生种与欧亚种葡萄杂交后代的白腐病抗性遗传进行了报道，认为白腐病抗性遗传是受多基因决定的。本试验以“红地球”ד双优”，“霞多丽”ד北冰红”的杂交后代群体作为试验材料，进一步开展了葡萄白腐病的抗性鉴定及遗传分析，为深入开展葡萄白腐病抗性相关研究打下了初步基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验与2017年6-9月进行。试材包括两部分：（1）感病的欧亚种葡萄品种“红地球”与抗病山葡萄品种“双优”FI杂交后代149株群体及亲本；（2）感病欧亚种葡萄品种“霞多丽”与抗病欧山杂交种葡萄品种“北冰红”F1杂交后代130株群体及亲本。供试葡萄植株现均种植于沈阳农业大学葡萄试验基地，长势良好。
1.2 试验方法
1.2.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基配制
葡萄白腐病病原菌是一种真菌微生物。根据其生物学特性，配制其生长繁殖所需要的PDA（Potato Dextrose Agar）培养基。称取干净的马铃薯切成200 g的小块置于电饭锅中，加入自来水约为1000mL，在电饭锅上加热，待其沸腾30min，用两层纱布趁热过滤，滤渣弃取。滤液补充自来水到1000mL。将20 g的琼脂粉加入盛有滤液的烧杯中，混合均匀，石棉网上小火缓慢加热，为了防止琼脂溢出或者糊底，要使用玻璃棒不断搅拌，等到所加的琼脂粉完全溶解后，再加入20 g的葡萄糖搅拌均匀，溶解后冷却10min，再补足自来水至1000mL。将已配制好的培养基分装入锥形瓶内，使用灭菌锅灭菌（121℃），20 min后锥形瓶取出，摇匀后备用。
1.2.2 白腐病原菌培养及孢子悬浮液制备
葡萄白腐病病原菌由北京市农林科学院植物保护研究所李兴红团队友情提供。病原菌采用PDA培养基，28°C黑暗，3-5天病菌培养。待长出孢子，用涂布器将孢子在PDA培养基中刮下，制备成孢子悬浮液，使用25×16型的血球计数板进行孢子悬浮液的浓度计算。经过前期几次不同孢子浓度试验，最终确定孢子侵染浓度为1×105个/ml。
1.2.3 试验群体白腐病抗性鉴定
“红地球”ד双优”和“霞多丽”ד北冰红”的后代群体单株及亲本在2017年时接受白腐菌侵染。利用室内离体叶片接种法对葡萄进行白腐病抗性鉴定，具体操作方法为：取枝条上中部叶龄为10-15 d的叶片，用蒸馏水清洗叶表面，将制备好的孢子悬浮液采用五针刺伤的方法接种在叶片的正面（避开叶片主叶脉），每个叶片接种三处，分布于叶片的不同位置，同时每个单株叶片设置3个生物学重复，放入在大培养皿下底内，培养皿盖子装有浸湿但不滴水滤纸，封口膜密封保湿，最终置于人工智能气候培养箱（MLR-352HPC，Panasonic）内，黑暗下培养（28℃，相对湿度为100%）。
白腐菌菌液接种72h后，使用智能叶面积测量仪（型号YMJ-C）统计叶面积及病斑大小，进行抗性鉴定并做好记录。通过对试验群体白腐病病抗性表型数据的统计和分析，最终获得统计分布直方图。
2 试验结果
2.1 葡萄白腐病原菌培养结果
图1 为白腐病原菌培养3d、4d、5d后，白色菌丝呈现稀疏状，菌落平伏，均匀分布已经产孢，活力及致病力都较强。
图2为万能显微镜观察到的白腐菌孢子，试验所需浓度为1×105个/ml,即五个黑框中有两个孢子即可。
2.2 亲本抗性鉴定
图3可明显看出，不抗病亲本比抗病亲本的病斑大，欧山杂交亲本北冰红病斑比山葡萄亲本双优病斑大，说明了选择试验材料的代表性及可行性。
2.3 群体白腐病抗性鉴定结果
图4为群体中部分后代单株叶片受到白腐菌侵染后发病情况。结果显示，试验群体单株发病部位病斑大小存在明显差异，抗病性呈现出多态性。
结合群体白腐病抗性鉴定所得的表型数据，利用SPASS软件得到该群体的抗性频率分布直方图（图5）。结果表明：试验群体单株发病部位病斑大小存在明显差异，抗病性呈现出多态性，后代白腐病抗性属于连续分布，符合数量性状遗传特点。鉴定结果可以用于后续葡萄白腐病抗性QTL位点的分析检测等研究。
3 小结
（1）PDA（Potato DextroseAgar）培养基用于葡萄白腐病原菌培养效果较好。
（2）鉴定结果表明，供试亲本间白腐病抗性存在显著差异，选择的试材具有代表性及可行性。
（3）两个试验群体各单株间白腐病病斑大小存在明显差异，后代白腐病抗性属于连续分布，符合数量性状遗传特点。