抗逆栽培研究室

翟衡　杜远鹏　马振强

 

　　建议用半微量凯氏法，设备比较简单易得，结果可靠，为一般实验室所采用。干烧法费时，操作复杂，需要专门的燃烧装置。

 

　　半微量凯氏法
　　(1) 方法原理：

　　用浓硫酸消煮，借催化剂和增温剂等加速有机质的分解，利用凯氏定氮仪使有机氮转化为氨进入溶液，最后用标准酸滴定蒸馏出的氨。

　　(2) 测定步骤：

　　① 称样：称取通过0.25mm孔径筛的风干试样0.5-1.0g，同时称样测定水分含量。
　　② 不包括硝态和亚硝态氮的样品消煮：将试样送入干燥的开氏瓶底部，加入1.8g加速剂，加水2ml润湿试样，再加5ml浓硫酸，摇匀。将开氏瓶置于变温电炉上，低温加热，待瓶内反应约10-15min时，提高温度使消煮的试液保持微沸，消煮温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处回流为宜。待消煮液和试样全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。冷却，待蒸馏。同时做两份空白测定。
　　③ 包括硝态和亚硝态氮的样品消煮：将试样送入开氏瓶底部，加1ml 0.05g/ml的高锰酸钾溶液，轻轻摇动开氏瓶。缓缓加入2ml 1+1硫酸溶液，转动开氏瓶。放置5min后，再加入1滴辛醇。通过长颈漏斗将0.5g还原铁粉送入开氏瓶底部，瓶口盖上小漏斗，转动开氏瓶，使铁粉与酸接触，待剧烈反应停止时（约5min），将开氏瓶置于电炉上缓缓加热45min（瓶内试液应保持微沸，以不引起大量水分损失为宜），停止加热，待开氏瓶冷却后，通过长颈漏斗加1.8g加速剂（100g硫酸钾、10g硫酸铜和1g硒粉的混合物）和5ml浓硫酸，摇匀。按上述②的步骤，消煮至试液完全变为黄绿色，再继续消煮1h，冷却，待蒸馏，同时做两份空白试验。
　　④ 氨的蒸馏：蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净（空蒸）。待消煮液冷却后，将消煮液全部转入蒸馏器内，并用少量水洗涤开氏瓶4-5次（总用水量不超过35ml）于150ml三角瓶中，加入10ml 2%硼酸-指示剂混合液，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上2-3 cm处，然后向蒸馏水瓶内加入20ml 10mol·l^-1氢氧化钠溶液，同入蒸气蒸馏，待馏出液体积约40ml时，即蒸馏完毕，用少量已调节至pH4.5的水冲洗冷凝管的末端。
　　⑤ 滴定：用0.01mol·l^-1盐酸标准溶液（或硫酸标准溶液）滴定馏出液，由蓝绿色滴定至刚变为红紫色。记录所用酸标准溶液的体积（ml)。空白测定滴定所用酸标准溶液的体积一般不得超过0.40ml。

　　(3)结果计算：
　　全氮（g· kg^-1）=(V－V₀) *c*0.014*1000/m；式中：V—滴定试液时所用酸标准溶液的体积，ml；V₀—滴定空白时所用酸标准溶液的体积，ml；0.014—氮原子的毫摩尔质量，g；c—酸的标准溶液浓度，mol·l^-1；m—烘干试样质量，g；1000—换算成每公斤含量。

 

　　测定硝态氮的方法包括两种，A：酚二磺酸比色法；B：0.01 mol·l^-1CaCl₂-紫外分光光度法。两种方法测定结果如表1所示，从试验结果我们可以看出：两种方法都可以准确用来测定硝态氮含量。其中方法A操作手续虽然较长，但有较高的灵敏度。测定结果的重现性好。方法B操作简单，有较高精度，但需要知道所测定地区土壤的校正因数R，这需要普查所测定地区的土壤，土壤有机质含量低于50ｇ/kg时可认为校正因数为2.2（据宋歌，2007）；

 

表1.　两种实验方法所测定的三种土壤样品的硝态氮含量

方 法	硝态氮含量（mg/kg）									0.9 μg.ml-1的KNO3标准溶液（ μg.mL-1）
	S1	S2	S3	G1	G2	G3	P1	P2	P3
A	8.97	8.91	8.88	6.92	7.04	6.95	2.31	2.32	2.38	0.88
B	8.70	8.05	8.41	7.00	7.02	6.98	2.35	2.18	2.27	0.89
A平均值	8.92			6.97			2.34			0.88
B平均值	8.39			7			2.27			0.89

注：S，山东农业大学南校区东边葡萄园；G，甘肃灰钙土；P，蓬莱中粮长城大果园基地

 

2.1　酚二磺酸比色法

　　(1) 方法原理：

　　土壤浸提液中的NO₃^--N在蒸干无水的条件能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO₃^--N含量在一定范围内成正相关，可在400-425nm处比色测定。酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mol·l^-1NO₃^--N，测定范围为0.1-2 mg·l^-1。

　　(2) 测定步骤：

　　将50.0g新鲜土样放在500ml锥形瓶中，加0.5 g硫酸钙和250ml水，加塞，用振荡机振荡10min后，将悬液的上部清液用干滤纸过滤，澄清的滤液用干燥洁净的瓶收集。

　　吸取清液25-50ml(含硝态氮20-150µg/ml)于蒸发皿中，加约0.05g碳酸钙，到达干燥时不应继续加热。冷却，迅速加人2ml酚二磺酸试剂，将皿旋转，使试剂接触到所有的燕干物。静止10min使充分作用后，加20ml水，用玻璃棒搅拌直到蒸干物全部溶解。冷却后缓缓加人1:1氨水，并不断搅拌，至溶液呈微碱性(溶液显黄色)，且多加2ml，以保证氨水试剂过量。然后将溶液定量地移人容量瓶中，加水定容。在分光光度计上用光径1cm比色皿，在波长420nm处进行比色。以空白试验溶液为参比液，调节仪器零点。

　　工作曲线绘制：分别取10μg/ml硝态氮标准溶液0，1，2，5，10，15，20 ml于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与待测液相同操作，进行显色和比色，绘制成工作曲线。

　　(3) 结果计算：

W_N=（c*V*t_s）/m*K₂,  t_s=浸提液总体积（ml）、吸取浸提液体积（ml），式中：W_N—硝态氮含量，mg/kg；c—从工作曲线上查的显色液的硝态氮浓度，µg/ml；V-显色液体积，100ml；m—风干图样质量，g；K₂—由风干土样换算成烘干图样的水分换算系数。

2.2　0.01mol/l CaCl₂浸提-紫外分光光度法        

　　(1) 方法原理：

　　利用0.01mol/l CaCl₂ 溶液提取土壤样品中的NO₃^--N，浸出液中的NO₃^-在紫外分光光度计波长约210nm处，有较强的吸光度，而浸出液中的其他物质，除OH^-、CO₃^2-、HCO₃^-、NO₂^-、Fe³⁺和有机质等外，吸光度均很小。将浸出液加酸酸化，即可消除OH^-、CO₃^2-、HCO₃^-的干扰。NO₂^-一般含量极少，也较易消除，因此，用校正因数消除有机质等物质的干扰后，即可用紫外分光光度法直接测定NO₃^--N的含量。

　　(2) 操作步骤

　　①土壤浸出液的制备

　　称取快速烘干的土样10.0g，放入200ml塑料瓶中，用溶液分配器加入50ml 0.01mol/L CaCL₂溶液（V₁）。用橡皮塞塞紧或盖好盖子，振荡30min，过滤，得到澄清滤液备测。

　　②浸出液中NO₃^--N的定量

　　用滴管吸取浸提液注入1ml光径的石英比色槽中，在210nm处约测吸光度，以0.01mol/L CaCL₂溶液调节仪器零点。根据约测结果，确定浸出液应稀释的倍数，用0.01mol/L CaCL₂溶液将浸出液准确稀释，使其吸光度在0.1-0.8。

　　吸取25.0ml待测液放在50ml三角瓶中，加1.00ml 10％H₂SO₄溶液，摇匀。用滴管将此液装入1cm光径的石英比色槽中，分别在210nm和275nm处测读吸光度即A₂₁₀和A₂₇₅。以酸化的浸提剂为参比溶液，调节仪器的零点。大批样品测定时，可先测完各液的A₂₁₀值，再测 A₂₇₅值，以减免逐次改变波长所产生的仪器误差。

　　校准曲线或回归方程：配制0mg/l、0.2mg/l、0.4mg/l、0.8mg/l、1.2mg/l、1.6mg/l、2.0mg/l的NO₃^--N标准系列溶液。各瓶中再加入2.00ml 10％H₂SO₄酸化，摇匀，在210nm处测读吸光度，以酸化的水（25.00ml水加1.00ml 10％H₂SO₄）调节仪器零点。绘制校准曲线或回归方程。

　　③结果计算

　　NO₃^-的吸光度（△A）=A₂₁₀-A₂₇₅×R；土壤NO₃^--N的质量分数ω（NO₃^--N）=ρ(N)×(V₁/m) ×f

　　式中：ω（NO₃^--N），ρ(N)为从校准曲线或回归方程求得的测定液中NO₃^--N的质量浓度，mg/l；V1为浸提液体积，ml；m为烘干或风干土样质量，g(新鲜样品应扣除水分)；f为浸出液稀释倍数（若不稀释f=1）。

　　④备注：

　　不同地区土壤的R值略有差异，各实验室在开展服务前应按照以下方法确定R值。

　　首先，在某一地区选取代表性土壤样品20个（包括不同土壤质地、不同肥力水平的土样，最好选用有田间试验的土壤），预先测定出各样品中的NO₃^--N含量，可采用常规方法（如经典的酚二磺酸吸光光度法）或仪器方法（如连续流动分析法）等测定或送到省级以上实验室测定。其次，做一条不同NO₃^--N浓度的工作曲线，在210nm处测定。根据此曲线可求出上述20个样品的A₂₁₀′值。然后，再用紫外分光光度法分别测定上述20个样品在210nm和275nm的吸光度，得到A₂₁₀和A₂₇₅，并根据公式R=（A₂₁₀- A₂₁₀′）/ A₂₇₅，最后求出R值。