酿酒微生物岗位

宋育阳 刘延琳

　　全球气候变暖给世界葡萄酒产业带来了深刻的影响，其中最为突出的现象是葡萄收获时的含糖量在过去的二十年里逐渐上升。在我国宁夏、新疆等酿酒葡萄主产区，这一现象的影响尤为严重。2013年，宁夏主栽的红色酿酒葡萄品种的含糖量普遍超过260g/L，有的葡萄园甚至高达290g/L；新疆产区的葡萄含糖量常常超过300g/L。大多数酒厂发酵时，普遍使用国外进口的广适性葡萄酒活性干酵母，面对高糖的葡萄原料，常出现较大范围的发酵迟滞、发酵终止等严重后果。鉴于此，生产上急需高糖利用能力强、发酵能力强、耐受性强、产酒精能力强的高产乙醇、具有综合优良性状的葡萄酒酵母。本文简要介绍酿酒酵母糖分利用的研究进展，以期对解决上述问题提供理论支持。

　　1　酵母葡萄糖利用机制

　　酵母拥有一系列的葡萄糖转运蛋白(HXTs)，它们具有不同的动力学性质，包括3个主要的葡萄糖信号通路——Rgt2/Snf3, AMPK和cAMP-PKA——以可获得的最合适的含量传递这些转运蛋白。这些途径与调控网络结合，确保葡萄糖有效的吸收和利用(Kim et al., 2013)。酿酒酵母糖酵解途径的动态模拟结果显示，糖酵解途径中，磷酸果糖激酶、己糖激酶和己糖转运系统具有较大的通量控制系数，随机改变细胞内外化合物的浓度对细胞能荷状态的模拟结果显示，酿酒酵母能在1min内将细胞的能荷状态恢复到初始水平(张元圣等, 2016)。

　　酵母葡萄糖利用及调控机制十分复杂，Snf1，Snf4以及Sip1，Sip2，Gal83具有解除结构基因导致的高葡萄糖浓度抑制的作用。而Snf1d的分子功能又受葡萄糖磷酸化阻遏物Mig1的抑制。Mig1p是一个DNA绑定蛋白，能够根据葡萄糖变化调控GAL和SUG基因的表达。

　　Mig1同样影响呼吸和糖异生作用的活性(Schuller, 2003)。Mig1p蛋白能够抑制MAL6 1、MAL62、MAL63(编码MALactivator)基因的表达，从而在葡萄糖胁迫中起作用（Nehlin etal., 1995）。Snf1蛋白激酶能够抑制Mig1并调节催化剂活性（Carlson,1998）。

　　Vaudano等人的研究表明，在干酵母活化过程中，葡萄糖和果糖的吸收受己糖转运蛋白的调控。将干酵母在蔗糖溶液中活化，在转录组水平存在高吸引力转运蛋白HXT2 和HXT4，低吸引力的转运蛋白HXT3 和HXT1，而HXT5和HXT6/7高表达，随后稳步降低。这些结果证明，在再活化过程中，转运蛋白的表达不仅与己糖的亲密关系有关，还受到其它复杂机制的调控（Vaudano e tal., 2010）。赵文英等研究了酿酒酵母EC1118 HXT3等位基因，发现突变的HXT3-champ基因对保证菌体发酵后期高果糖利用能力起到了重要的作用(赵文英等, 2015)。

　　当环境中含有葡萄糖时，酿酒酵母会优先利用葡萄糖，而抑制其它糖的利用，这一机制通过两个途径实现，途径1是使用Rgt2p作为胞外葡萄糖传感器，导致麦芽糖酶透性酶蛋白失活；途径2依赖葡萄糖运输途径，刺激透性酶蛋白失活，从而使麦芽糖运输活性迅速失活。

　　途径2很大程度上依赖HXK2，小部分依赖HXK1，Jiant等认为途径2和葡萄糖抑制依赖相同的上游组件，并证明葡萄糖转运通过半乳糖透性酶刺激途径2，而使用半乳糖和麦芽糖发酵足以形成途径2信号，认为途径2响应高速率的糖发酵并监测细胞内代谢信号，并非特定的葡萄糖代谢信号（Jiant et al., 2000）。

　　Bea等人的研究表明，通过缓解代谢阻遏，在微氧条件下，敲除HXK2 的菌株仍能有效的利用葡萄糖和半乳糖（Bae et al., 2014）。

　　PSK2激酶在葡萄糖吸收和储藏性碳水化合物合成方面起重要的调节作用，从而使细胞处于一个比较稳定的震荡状态（Ouyang et al.,2011）。PFK27在酿酒酵母中编码6-磷酸果糖-2-激酶，受葡萄糖和蔗糖诱导。Boles等人构造了一个缺乏6-磷酸果糖-2-激酶的菌株，该菌株在各种碳源浓度的环境中生长良好，细胞中磷酸己糖含量上升，但葡萄糖代谢流和乙醇产量于野生菌株无异，但当将其从有氧环境中转入发酵环境，细胞进入一种过渡状态。

　　认为果糖-2,6-二磷酸在6-磷酸果糖-1-激酶/果糖-1.6-二磷酸酶对中是一种重要的效应器，并是在细胞从有氧环境转移到无氧发酵环境中时一种重要的启动因子，而在葡萄糖环境中可被其它因子或调节机制所替代（Boles et al., 1996）。

　　缺乏磷酸葡萄糖异构酶(PGI 1 编码)的酿酒酵母因为缺乏NADPH在氧化机制，而不能使用磷酸戊糖途径氧化葡萄糖。Heux等人检测了不同起源的11株酿酒酵母的磷酸戊糖途径代谢流的G6PDH(磷酸脱氢酶)和HXK(已糖激酶)活性，实验结果表明，不同的酿酒酵母的磷酸戊糖途径能力具有较大的种内多样性，而低能力可能是该途径葡萄糖氧化的主要限制因子（Heux et al.,2008）。

　　Watanabe等人的研究表明，减少葡萄糖到UDPG(二磷酸尿苷葡萄糖)和1,3-β-葡聚糖的合成代谢，会引起Rim-15p介导的缺陷，上调PGM2和UGP1，从而使葡萄糖代谢流流向糖酵解方向。因此，下调UDPG合成途径可以促进工业酒精发酵进程（Watanabe et al., 2015）。

　　据相关文献报道（Herraiz e tal., 1990; Romano, 1997; Esteve et al.,2000; Brandolini et al., 2002），较高的初始葡萄糖浓度对乙醇发酵有明显的抑制作用，且在不同糖浓度发酵过程中生长代谢与底物消耗及乙醇生成密切相关，因此，研究不同初始葡萄糖浓度下酒精发酵过程中各时间段内葡萄糖利用率，酵母生长及乙醇生长的变化过程及相互关系对酿酒酵母发酵性能的把握具有重要意义。

　　2　酵母果糖利用机制

　　研究表明，乙醇的存在，对酿酒酵母利用果糖的抑制作用大于葡萄糖；而增加氮源，能够使酿酒酵母对果糖的利用增强作用高于葡萄糖。发酵期间，酿酒酵母对葡萄糖和果糖的利用依赖于酵母菌株的固有特性和外部环境（Berthels et al.,2004）。

　　酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)常常被筛选作为葡萄酒酒精发酵菌种（Dumont et al., 2009）。葡萄浆汁中葡萄糖和果糖含量基本相等，但在酒精发酵过程中，酿酒酵母通常利用葡萄糖的能力比利用果糖的能力强。其结果是果糖与葡萄糖比例随着发酵的进行不断升高，以致在发酵后期果糖成了主导糖（Gafner e t a l., 1996）。有研究表明，酿酒酵母的低果糖利用能力与发酵停止、发酵后期发酵速率低和发酵不彻底密切相关（Gafber et al.,2010）。另外，由于果糖不能被有效利用而残留在葡萄酒中，一方面果糖甜度高，会造成葡萄酒口感失衡；另一方面，酒中残糖的存在具有引发微生物污染的危险（Berthels et al. 2004; Santos et al. 2008）。因此，研究果糖对酿酒酵母的影响是一项重要内容。

　　3　酿酒酵母高糖胁迫反应机制

　　近年的研究结果表明，在高糖胁迫下，细胞内也会产生过量的ROS(reactive oxygen species, ROS)和RNS(reactive nitrogen species,RNS)等有害物质，会促使线粒体产生超氧化物并激活一氧化氮合酶，形成过氧亚硝基，致使机体进一步被氧化而受损伤（Notio et al.,2015）。在生物体内，过量的活性氧、氮化物等氧化物会对生物体产生不同程度的伤害，造成细胞损伤，甚至凋亡。目前，关于氧化应激反应在酿酒酵母中已有很多相关报道，但普遍认为超氧化物歧化酶(SOD)是重要的活性氧(ROS)清除剂，对维持生物体内 ROS 的动态平衡中起重要作用(冯宇等, 2013)；另外，提高SOD和CAT活性可显著提高其对逆境的耐受能力。除此之外，研究认为过氧化物酶(POD)与高糖耐受力也紧密关联(熊雅兰等,2014)，但具体的分子作用机制尚不清楚。

　　徐晓丹等人的研究结果表明，高糖胁迫不影响酵母(Saccharomycesc e r e v i s i a e)胞内活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)水平，但显著降低了胞内酶活性(P<0.05,P<0.01)；过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性对高糖耐受性反应更为灵敏，可作为衡量高糖胁迫应激机制的重要生理指标；qRT-PCR结果表明高浓度葡萄糖显著抑制了酵母中GPD2(编码 3-磷酸甘油脱氢酶)和SUC2(编码蔗糖转化酶的重要基因)的表达水平(P<0.05)，并极显著提高了HXT 1(己糖代谢途径中负责葡萄糖转运的重要基因)的表达水平(P<0.01)，而对GUT1的表达影响不显著(徐晓丹等, 2016)。