育种研究室无核品种选育岗位

王跃进 张剑侠 徐炎 张朝红

　　无核葡萄胚挽救育种的第二个主要环节是指在大田杂交后的幼胚发育与其萌发成苗，即幼胚珠离体发育和离体发育的胚萌发成苗阶段。其技术操作步骤与要求是：

　　1　杂种幼胚珠离体发育

　　大田杂交完成后，根据母本的花后授粉日期及其败育的时间，确定在败育前采集田间杂交幼果，剥出幼胚珠，在离体条件下提高培养基的较高浓度的蔗糖（5%-6%为宜），使幼胚珠进行离体发育。不同品种的胚败育时间不同，采样时期也不同。幼胚珠离体发育培养阶段的具体步骤为：取杂交果实，接种前先用流水冲洗果粒1-2小时，置于广口瓶中，全程在超净工作台上进行。消毒方法选用二次消毒法，先用75%酒精浸泡消毒30秒后无菌水冲洗3次，之后再用5%次氯酸钠溶液，用前滴加几滴Tween20，浸泡消毒15分钟，消毒期间不断振荡，以保证瓶中的材料充分接触消毒剂，然后用无菌水漂洗3-5次。消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下用无菌的镊子和手术刀切开果实，取出杂种幼胚珠，选取长度大于2mm的胚珠接种在“固-液双相”的幼胚珠发育培养基中，固相和液相培养基除琼脂外其它成分完全相同，目前适宜胚珠发育的培养基主要有White培养基、ER培养基、Nitsch培养基、NN培养基等。培养基中加入较高浓度的蔗糖（5%-6%为宜）可以提高培养基的渗透压，一是有利于前期幼胚的正常发育，使幼胚的早熟萌发受阻，二是保证了培养基中的活性物质供幼胚发育的营养。由于葡萄果实中含有较多的酚类物质，在胚挽救过程中，容易褐变，影响胚挽救的成苗率。所以，在培养基中加入适量的抗褐化剂或吸附剂，可以减少褐化，常用的抗褐化剂或吸附剂为活性炭。因此，胚珠离体发育培养阶段培养基主要成分为：

　　ER或Nitsch或NN＋60g/L蔗糖＋3g/L活性炭。将杂种幼胚珠接种在100ml三角瓶中，每瓶接种15粒，在组培室盖上黑布进行黑暗离体培养，培养温度为25±2℃，相对湿度50-60%。胚挽救技术中，胚珠离体培养中关键在于对采集的杂交果粒进行充分的消毒工作，以保证在无菌环境中操作。

　　2　离体发育的胚萌发成苗

　　待胚珠离体发育培养8周后，在超净工作台中，通过透视显微镜观察将发育的胚从胚珠中取出，并放在胚萌发成苗培养基上，每个100ml的三角瓶接种1个胚。此阶段为胚萌发成苗阶段，常用的胚萌发培养基主要有MS和WPM两种。在此阶段，蔗糖浓度较低，以便有效的解除高渗透压对胚萌发的抑制作用，促进发育后的胚萌发成苗，降低畸形苗的形成。在胚萌发阶段，加入细胞分裂素类物质6-BA可促进胚的萌发。因此，胚萌发及成苗培养基主要成分为：WPM或MS或1/2MS＋15g/L蔗糖＋0.2mg/L6-BA＋1g/L活性炭，以便成苗。