天津综合试验站

李凯 黄建全 聂松青 张世兴 辛微

　　摘 要：应用顶空固相微萃取技术提取玫瑰香葡萄酒的香气组分，结合气相色谱质谱技术对香气成分进行定量分析，研究二氧化碳浸渍发酵对玫瑰香葡萄酒香气成分的影响，共检测出54种香气成分，包括9种萜烯类、30种酯类、9种醇类、4种酮类、1种脂肪酸类和1种芳烃类，不同酒样的总香气含量略有差异，但均以醇类和酯类为主。主成分分析结果显示，二氧化碳浸渍发酵和传统工艺发酵的酒样存在差异，两组酒样可以在前两个主成分上基本聚集为两类；此外，丙酸乙酯、乙酸丙酯、水杨酸甲酯、乙酸香茅酯、邻苯二甲酸二丁酯、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-苯乙醇、正癸醇和苯乙烯与二氧化碳浸渍发酵的酒样相关性较强，在二氧化碳浸渍发酵的酒样中浓度较高；乙酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇、2-壬酮和2-癸酮与传统工艺发酵酒样的相关性较强，且在传统工艺发酵的酒样中浓度较高。采用气味活度值分析关键呈香成分，结果显示二氧化碳浸渍发酵的酒样中关键呈香成分有14种，包括里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸，相比传统工艺发酵酒样的关键呈香成分有所减少。

　　关键词：玫瑰香；二氧化碳浸渍；香气成分；顶空固相微萃取(HS-SPME)；气相色谱质谱技术(GC-MS)

　　本实验以天津产区玫瑰香葡萄酒为研究对象，采用固相微萃取技术提取葡萄酒香气成分，用气相色谱-质谱分析法对葡萄酒香气成分进行检测，利用内标-标准曲线法量化分析并结合主成分分析及气味活度值分析葡萄酒香气成分，对比传统发酵工艺，分析二氧化碳浸渍发酵对玫瑰香葡萄酒香气成分的影响，以便为客观评价葡萄酒香气质量及优化工艺提供理论依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　酒样

　　试验以酿酒鲜食兼用品种玫瑰香葡萄（vitis vinifera L.cv. MuscatHamburg）为原料，于2016年9月8日采自天津宁河区，可溶性固形物含量为17 Brix°，成熟度一致，无病害。参照李华等人的干红葡萄酒基本工艺，采用小容器发酵法进行酿造实验，发酵容器为40 L不锈钢罐。如表1所示，处理组为酒样1至9，采用二氧化碳浸渍发酵法，将不同程度破碎的葡萄入预先填完2-3倍体积CO2发酵罐中，并用50 mg/L SO2封罐，按照浸渍天数要求，进行CO2浸渍，浸渍完成后葡萄经除梗破碎后转入发酵罐；对照组为酒样10至12，采用传统干红发酵工艺，不经过二氧化碳浸渍，直接除梗破碎转入发酵罐。处理组和对照组的葡萄醪均按照 20mg/L的浓度添加果胶酶，12h后按照200mg/L 的浓度添加商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，用 5%蔗糖水在37℃温度下活化 30 min后添加）。待发酵启动后，每隔4～6h测定1次温度与比重，并压酒帽。待比重降到 0.992～0.996，并基本维持不变后进行皮渣分离。最后向酒样中加入50mg/L的二氧化硫，储藏备用。

　　1.1.2　设备与试剂

　　无水乙醇：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；标样：β-蒎烯、柠檬烯、异松油烯、(+)-4-蒈烯、里那醇、玫瑰醚、α-松油醇、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、异丁酸乙酯、乙酸异丁酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、辛酸甲酯、丁二酸二乙酯、水杨酸甲酯、乙酸辛酯、辛酸乙酯、2-辛烯酸乙酯、己酸异戊酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、乙酸香茅酯、反式-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、十四酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、苯甲醇、2-苯乙醇、正癸醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-壬酮、2-癸酮、辛酸、苯乙烯、2-辛醇，均购自Sigma-Aldrich公司；气相质谱联用仪：5977A-7890B GC-MS联用仪（Agilent，美国）；CTC自动进样装置（Agilent，美国）；萃取头：50/30μm DVB/CAR/PDMS型极性（Supelco，美国）；色谱柱：HP-5MS毛细管柱( 3 0m×0.25mm×0.25μm，Agilent)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　葡萄酒基本理化指标分析

　　可溶性固形物、总糖、可滴定酸、挥发酸、干浸出物、酒精度和pH的测定均参照王华等人的方法。

　　1.2.2　气相色谱-质谱仪( GC-MS)分析条件

　　色谱条件：载气(高纯氦气)：纯度≥99. 999%，流速1.0 mL/min，分流比为5:1；升温程序：35℃保持2 min，以4℃/min升至200℃，以30℃/min升至250℃，保持5 min；进样口温度：250℃。

　　质谱检测条件： 离子源温度：230 ℃；传输线温度：250℃；电子轰击源：70 eV；扫描范围：30~300 amu。

　　1.2.3　定量分析

　　利用顶空固相微萃取-气质联用( HS-SPME-GC-MS)分析方法。称取2.4 g NaCl于20 mL顶空瓶中，然后加入葡萄酒样8 mL，并加入内标物2-辛醇8 μL（450 mg/L，无水乙醇稀释），顶空瓶加盖密封后待测。CTC固相微萃取条件：45℃预热5 min，磁力搅拌子转速为250 r/min（搅拌间歇式运行，转5 s，停2 s)，45℃萃取50 min，然后GC进样，250℃解吸2 min，采集数据。

　　目标化合物峰面积积分采用选择离子模式( SIM)，采用内标-标准曲线法定量，标准曲线由5点绘制，由化学工作站计算定量结果。

　　2　结果与分析

　　2.1　葡萄酒中香气定量分析

　　通过顶空固相微萃取(HeadSpace Solid Phase Microextractions，HS-SPME) 和 GC-MS 联用技术对材料进行香气成分含量分析，葡萄酒香气成分含量见表2。通过定量分析，共检测出54种香气成分。按照结构和特性将香气成分分为6类，分别是萜烯类、酯类、醇类、酮类、脂肪酸类和芳烃类。由图1可以看出，不同酒样的总香气含量方面存在差异，所有酒样的香气成分均以醇类和酯类为主，其中醇类含量最高，酯类次之，其余类型含量较低。所有酒样香气成分的总含量在117.1-142.4mg/L之间，其中萜烯类包括9种香气成分，总量在649.8-1617.3 ug/L之间，该类香气成分含量较低，仅占总含量的0.55%-1.21%，其中β-蒎烯、里哪醇、香茅醇和香叶醇的含量相对较高（＞100 ug/L）。值得注意的是，经过二氧化碳浸渍处理的9个酒样(W1-W9)的萜烯类含量全部高于3个对照组酒样。酯类香气成分的种类最丰富，共检测到30种香气成分，但含量仅占总含量的25.38%-32.76%，远低于醇类；乙酸乙酯含量最高，在24555.9-27973.4 ug/L之间。醇类虽然只有9种香气成分，但含量最多，占香气成分总含量的65.27% -72.89%，其中3-甲基-1-丁醇在所有香气成分中含量最高。此外还检测出4种酮类成分、1种脂肪酸和1种芳烃，值得关注的是，在二氧化碳浸渍发酵的9个酒样中全部检测到微量的苯乙烯（6.07-37.73 ug/L），而传统发酵条件的玫瑰香葡萄酒中均未检测到。

　　2.2　香气含量的主成分分析

　　主成分分析法利用降维思想，通过研究指标体系的内在结构关系，把多指标转化成少数几个相互独立而且包含原有指标大部分信息的综合指标，得到的综合指标（主成分）之间彼此独立，减少信息的交叉，使得分析评价结果具有客观性和准确性。根据香气定量分析结果，将所有玫瑰香葡萄酒的香气成分含量构成一个12×54的原始数据矩阵，然后运用SPSS v 17.0数据处理系统对54个成分指标进行处理，最终提取出8个主成分，它们的累计方差贡献率为96.98%（表3）。其中前两个主成分可以解释总方差的68.657%，根据酒样在前两个主成分上的分布（图2a），处理组和对照组之间的差异明显，处理组9个酒样中的8个均聚集在第一和第二象限聚集，而对照组则全部聚集在第四象限。对于酒样W9，可能是由于二氧化碳浸渍时原料破碎程度最大（20%），且浸渍时间最长（15天），导致该酒样与处理组其它8个酒样之间的香气成分差异明显，因此在分析处理组的特征香气时，以聚集在第一和第二象限的8个酒样为主。根据香气成分在前两个主成分上的分布（图2b），处理组特征香气成分包括丙酸乙酯、乙酸丙酯、水杨酸甲酯、乙酸香茅酯、邻苯二甲酸二丁酯、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-苯乙醇、正癸醇、苯乙烯，这10种香气成分与处理组8个酒样在前两个主成分上的分布特征一致，均与第2主成分呈正相关，在含量上的表现为处理组浓度普遍高于对照组；而对照组特征香气成分为乙酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇、2-壬酮、2-癸酮，这11种香气成分与对照组的3个酒样在前两个主成分上的分布特征一致，均与第1主成分呈正相关，同时与第2主成分呈负相关，在含量上的表现则是对照组浓度显著高于处理组。然而，香气成分实际浓度与香气真正的贡献率并不成正比，而与其气味活度值有着直接关系，气味活度值也体现出香气成分的挥发性大小及难易程度，因此将香气成分含量与阈值结合起来分析，更能客观地认识某种香气成分在葡萄酒香气中的贡献。

　　2.3　关键呈香成分分析

　　根据香气值理论，葡萄酒中香气成分含量高且阈值低的成分很可能是葡萄酒的特征香气或主体香气成分。在香气贡献中，由于香气成分之间的相似性，难免有些香气成分之间充斥着重叠和抑制作用，但对于估计单个香气成分实际气味贡献来说，采用气味活度值（OAV）来表征葡萄酒中各香气化合物对主体香气成分的贡献，是目前具有一定参考价值的客观方法，当OAV大于1时，这种香气成分对香气的贡献和影响较大。根据OAV值，共确定15种关键呈香香气成分（见表4），包括4种萜类、6种酯类、2种醇类、2种酮类和1种脂肪酸，分别是里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸。

　　15种关键呈香成分中辛酸乙酯的OAV值最高，主要贡献果香和脂肪气味，其它5种酯类的香气描述则是菠萝、苹果和香蕉等果香，因此酯类主要为玫瑰香葡萄酒提供果香。大马酮的OAV值仅次于辛酸乙酯，大马酮属于C13-降异戊二烯衍生物，被认为是潜在影响葡萄和葡萄酒质量的芳香化合物，这类化合物主要来自类胡萝卜素的降解，具有强烈的果香和玫瑰香气，并且具有极低的香气阈值(0.05 ug/L)，它们在提高水果香气特征的同时掩蔽草本香气。里那醇、玫瑰醚、香茅醇和香叶醇都属于萜类化合物，萜类化合物主要来源于果实，在葡萄储藏或发酵过程中很少或不发生改变，是形成品种香气的重要化合物，玫瑰香葡萄独特的品种香气玫瑰味就来自于该类化合物，其中玫瑰醚由于其低嗅觉阈值（0.2ug/L），是OAV值最高的萜类化合物，在整体香气中贡献花香、甜香和玫瑰香味。3-甲基-1-丁醇在所有检出香气成分中浓度最高，然而由于其高嗅觉阈值（30 mg/L），OAV值仅在2.22和2.69之间，乙酸乙酯和2-苯乙醇也同样如此，这也说明某种香气成分具有高浓度并不意味着对葡萄酒整体香气贡献大，而是与其嗅觉阈值密切相关。辛酸属于低级脂肪酸，具有明显奶酪，并夹带粗涩的味感，然而对整体酒质结构具有重要作用，并且可以抑制芳香酯的水解，因此对于香气平衡具有重要作用。Shinohara T研究表明，高含量(大于20 mg /L) 的 C6-C10脂肪酸则具有不良风味的体现，然而低含量时反而能够带来具有愉快的气味，本研究中辛酸浓度范围是0.75-1.31 mg/L，可能会给整体香气带来愉悦气味。

　　15种关键呈香成分的气味描述以令人愉悦的果香和花香为主，同时包括提升香气复杂度的蜂蜜、脂肪和奶酪等香气描述，与感官评价时玫瑰香葡萄酒的香气特征高度一致，这也证明了玫瑰香葡萄酒的香气主要来源于这十几种关键呈香成分。值得我们关注的是，异丁酸乙酯在处理组中的OAV值均小于1，而在对照组中大于1，因此与传统工艺相比，二氧化碳浸渍发酵条件下玫瑰香葡萄酒的关键呈香成分略有减少。

　　3　结论

　　本研究通过HS-SPME 和 GCMS联用技术分析二氧化碳浸渍发酵对玫瑰香葡萄酒香气成分的影响，共检测出54种香气成分，其中苯乙烯仅在二氧化碳浸渍发酵的酒样中检测到，其余53种香气成分是所有酒样的共有香气成分，包括9种萜烯类、30种酯类、9种醇类、4种酮类和1种脂肪酸类，不同酒样的总香气含量略有差异，但均以醇类和酯类为主。

　　主成分分析结果显示，二氧化碳浸渍发酵与传统工艺发酵条件下的酒样在前两个主成分上聚集为两类，存在明显差异；二氧化碳浸渍发酵条件下，玫瑰香葡萄酒中丙酸乙酯、乙酸丙酯、水杨酸甲酯、乙酸香茅酯、邻苯二甲酸二丁酯、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-苯乙醇、正癸醇和苯乙烯的浓度较高；传统工艺条件下，玫瑰香葡萄酒中的乙酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇、2-壬酮和2-癸酮的浓度较高。

　　采用气味活度值分析关键呈香成分的结果显示，传统工艺条件下玫瑰香葡萄酒中的关键呈香成分有15种，包括里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸；二氧化碳浸渍发酵条件下玫瑰香葡萄酒中的关键呈香成分减少为14种，不包括异丁酸乙酯。

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