病毒病防控岗位

董雅凤　裴光前　范旭东　张尊平

　　葡萄卷叶病（Grapevine leafrolldisease，GLD）是分布最广泛，危害最严重的葡萄病毒病之一。染病葡萄树势衰退，果实成熟期推迟，果穗着色不良，含糖量降低。2016年日本Takao Ito新发现了一种葡萄卷叶相关病毒，拟命名为葡萄卷叶相关病毒13（GLRaV-13），迄今为止全世界已报道了10余种葡萄卷叶相关病毒，此类病毒属长线病毒科(Closteroviridae)，其侵染可引起葡萄卷叶病的发生。在生产中，葡萄叶片的症状表现是田间识别葡萄卷叶病的重要依据，具有较高的诊断价值。然病原不明，不利于脱毒与防控，为此，本研究通过田间调查采样，并结合实验室的ELISA和RT-PCR检测技术，对我国葡萄卷叶病的病原进行了鉴定分析。

　　1　材料与方法

　　1.1 材料

　　在中国农业科学院果树研究所葡萄品种保存圃内进行症状调查，共调查200个品种，结果82个品种表现葡萄卷叶病症状，从中标记了58株。休眠期从标记的病株上剪取一年生休眠枝条，保存于4℃冰箱中。根据文献报道与Genbank中登录的序列信息，设计或筛选了11种葡萄卷叶相关病毒（GLRaV-1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, Pr, De）的PCR检测引物，购买了6种葡萄卷叶相关病毒（GLRaV-1, 2, 3, 5, 6, 7）的ELISA检测试剂盒。

　　1.2 方法

　　刮取100 mg休眠枝条韧皮部组织，采用改进的二氧化硅吸附法提取总RNA，以总RNA为模板反转录成cDNA后，进行PCR扩增。刮取300 mg休眠枝条韧皮部组织，按ELISA试剂盒操作说明进行病毒检测。为确定检测引物的特异性，对相应葡萄卷叶病毒进行了RT-PCR。将扩增得到的RTPCR产物用PCRFragment RecoveryKit (TaKaRa) 进行回收纯化，与pMD18-T Vector (TaKaRa) 连接后转化E. coli DH5α感受态，经蓝白斑筛选, 挑取白色菌落进行培养，重组质粒由北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，测序结果与NCBI核酸数据库中报道的相应病毒序列进行同源性分析。

　　2　结果与分析

　　2.1 田间调查

　　10月份在葡萄品种保存圃内调查葡萄卷叶病发生情况，红色品种发病初期叶脉间出现暗红色小斑块（图1A，赤霞珠），随后色斑扩大，整个叶片变为暗红色（图1B，蛇龙珠），叶片增厚变脆，但叶脉仍保持绿色（图1C，皇家秋天），严重时整株叶片表现症状，树势减弱（图1D，梅鹿辄）。白色品种初期叶脉间出现黄色小斑块（图1E，郑果大无核），随后色斑扩大，整个叶片变黄，叶脉基本不变色（图1F，雷司令），严重时整株叶片也会表现症状。调查结果显示，欧亚种群中表现葡萄卷叶病症状的品种最多，发病率最高，发病症状也最为严重；欧美杂种也有表现葡萄卷叶病症状的品种，但是发病率和严重度均要比欧亚种群低；未见美洲种群的品种表现葡萄卷叶病症状。

　　2.2 引物的特异性

　　从RT-PCR电泳结果来看，每对引物都能扩增出清晰的目标条带（图2），引物LR1-1A/1B，LR2-2U/2D，LC1/ LC2，LR4CP-U/D，LR4F1/R1，HSP4A/4B，LR5-F2/R2和LR7-F2/R2所扩增出的cDNA片段大小分别是：232，333，546，300，319，441，690和502bp。

　　2.3 　ELISA和RT-PCR检测结果

　　为调查我国葡萄卷叶病毒的种类，利用ELISA和RT-PCR方法对58份葡萄样品进行了检测，GLRaVs总检出率为81.0%，检测到GLRaV-1, 2, 3, 4, 5, 7 等6种葡萄卷叶病毒，其中，GLRaV-3检出率最高，为62.1%，GLRaV-1，2和7检出率分别为20.7%，17.2%和15.5%；GLRaV-4和5的检出率较低，分别为3.4%和5.2%。20个样品检测到2种卷叶相关病毒，占34.5%，3个样品检测到3种卷叶相关病毒，占5.0%，1个样品检测到4种卷叶相关病毒，占1.7%。

2.4 目的基因克隆和序列分析

　　将回收到的目的基因片段进行克隆和DNA序列测定，并将测序结果与NCBI数据库中已报道的病毒序列进行同源性比较。结果显示，扩增获得的6种葡萄卷叶病毒基因片段与NCBI中已发表序列高度同源（94%~99%）。

　　3　小结

　　经检测，GLRaV-1和-3是我国葡萄卷叶病毒的主要病原。2种或3种葡萄卷叶病毒复合侵染现象比较普遍，占所检测样品的42%田间采集的带有明显葡萄卷叶病症状的休眠枝条，卷叶病毒检出率并非100%，而是81%，另有19%的样品未检出病毒，这可能与我们目前所能检测的病毒种类有限有关，另外，病毒在植株体内的分布不均衡，病毒浓度过低，或者病株中存在较多的干扰物质均等也会影响检测结果。由于葡萄卷叶病病原复杂，明确病原病毒需要进行多种病毒的系列检测，因此在培育脱毒品种的过程中，定期观察症状表现或采用指示植物进行鉴定也具有十分重要的意义。