加工品种选育岗位

唐晓萍团队

　　摘要：为了更好的保护、促进优异葡萄种质资源的有效区分和合理利用，利用SSR 标记技术对在太谷葡萄圃及国家葡萄产业体系加工品种选育岗位保存的酿酒葡萄品种（系）材料中选取的15份特异性资源进行亲缘关系的分析、分类、种质识别。本研究从44对SSR 引物中筛选出15对用于葡萄的SSR 扩增，共扩增出74 条带，其中多态性条带71条，多态性百分率为95.9%。根据SSR 扩增结果，分析表明15份葡萄材料的遗传距离的变异范围为0～1.092 4。UPGMA 聚类分析表明，在遗传相似系数0.63 处，可将15份供试材料分为2 个类群。有效地显示出每份葡萄种质的特异性。通过多态性谱带的有序编码转换，构建了15个葡萄品种的分子身份证系统，结果表明利用SSR标记进行酿酒葡萄种质资源的鉴定和保护是可行的。

　　关键词：葡萄；SSR 标记；聚类分析；分子身份证

　　葡萄为葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis)的一种重要果树，品种数目繁多。截止2015年统计结果表明全世界葡萄种植面积达753.4万公顷，中国的葡萄种植面积增至82万公顷，超过法国，仅仅落后于西班牙，跃居全球第二位；全世界葡萄酒产量277.4亿升，我国以11亿升位居第九。葡萄种植面积在逐年增加，葡萄酒产量稳中有降。就保存的葡萄资源来看，全世界大约有5000-15 000多种，其中在栽培上应用或在资源圃中保存的约有8 000个，而我国种质资源圃中保存的大约有2 000多种。随着选育及审定品种迅速增加，葡萄在表型特征上的变异越来越丰富，以及苗木生产、品种及知识产权保护、种质资源管理、葡萄育种需求，葡萄种质资源鉴定的重要性越来越突出，但传统的依据形态特征的种质鉴定方法在品种鉴别方面的难度越来越大，分子生物学鉴定的应用越来越广泛。

　　目前国内外利用SSR（SimpleSequence Repeat）分子标记技术已在苹果、李子、枣、马铃薯等多种园艺作物的品种鉴定、多样性分析、遗传作图以及基因定位等方面取得成功，其共显性标记，多态性高，非常利于进行种质资源的遗传多样性分析。在葡萄种质资源研究方面，SSR分子标记技术也受到越来越多的研究者的重视。郭春苗等利用8对SSR引物对44个新疆地区栽植的葡萄品种进行了亲缘关系分析，杜晶晶等依靠SSR分子标记对80份葡萄种质构建了分子身份证，Nami Goto-Yamamoto等利用SSR标记对葡萄野生类型及栽培类型间的遗传关系进行了深入探索， SSR基因分型结果显示，基于距离的主坐标分析可以将野生种和栽培种明显区分开来，且野生种比栽培种更加多样化。冷翔鹏等利用SSR和RAPD 2种标记分别对22个遗传关系明确的巨峰系葡萄品种进行遗传分析，证明了两种标记用于葡萄种质资源遗传多样性分析的可靠性。

　　李慧等利用SSR和IRAP标记对湖北‘关口葡萄’与欧亚种、欧美杂交种、美洲种间的亲缘关系进行了分析，‘关口葡萄’与欧美杂交种‘尼加拉’和‘白香蕉’亲缘关系最近,与美洲种‘康可’和‘郑果6号’亲缘关系较近,而与其他欧亚种品种的遗传关系相对较远。樊秀彩等通过SSR标记对山葡萄与河岸葡萄种间的杂交后代进行了杂种鉴定，有效地区分了其中的真杂种与杂交后代变异种质，表明SSR标记可以有效地对葡萄属种间杂交后代进行真实性鉴定，可作为葡萄种质创新的有效辅助手段。陶巧静等对葡萄诱变群体进行了SSR分子标记研究，验证了SSR标记用于葡萄诱变单株分子鉴定的可行性。但由于当时采用的方法多为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法，印染显影后分离条带有时无法区分，无法确定分子量大小，会造成不同样品数据比对中产生误差，降低了检测的效率及精确性，难以对大规模不同品种DNA指纹鉴定数据进行有效整合和准确比较。

　　与聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离SSR扩增片段结果相比，荧光标记毛细管电泳法具有灵敏度高、准确性强、效率高、在遗传多样性分析方面更精确可靠等优点，更适用于高通量材料的检测分析。目前，已在玉米、水稻、大豆、棉花等作物中得到广泛应用。匡猛等采用36对SSR核心引物，利用多重PCR技术与毛细管电泳检测技术，对138个棉花品种构建了指纹库；王燕龙选取9对多态性及特异性较好的引物，分别用银染法和荧光检测法扫描了85个栽培品种的SSR标记多态性；尹玲等对近年来中国新育成的葡萄品种进行了SSR指纹图谱的构建，明确了品种间的亲缘关系，但研究材料主要集中于我国近几年新选育的鲜食品种，涉及的酿酒品种较少。我国葡萄种质资源丰富多样，仍有很多材料遗传关系不清，还未达到直观简洁鉴定种质的目的。尤其众多酿酒品种种质资源多来源于国外，遗传背景复杂，这为种质鉴定评价及育种研究带来种种困扰。

　　本研究在前期对国家种质资源葡萄太谷枣、葡萄圃及国家葡萄产业体系加工品种选育岗位500余份葡萄品种（系）的品质评价和加工适宜性分析的基础上，以15份具有代表性的酿酒葡萄品种为实验材料，通过毛细管电泳技术筛选SSR引物，获得构建指纹图谱的核心引物，并建立15份酿酒葡萄品种的指纹图谱，对筛选出的15份代表性酿酒葡萄种质资源品种（系）进一步进行SSR 标记的亲缘关系分析及分子身份证系统建立研究，以期为我国酿酒葡萄品种DNA指纹数据库的构建奠定基础，为我国酿酒葡萄种质资源亲缘关系研究和葡萄分子标记辅助育种工作提供了理论依据。

　　1　材料与方法

　　1.1 试验材料

　　供试的15个葡萄品种的实验材料均采自于山西省农业科学院果树研究所国家枣、葡萄种质资源圃与国家葡萄产业体系加工品种选育岗位资源圃，所选15个葡萄品种均为酿酒品种，详见表1。2014年5月底采集各葡萄品种的幼嫩叶片，液氮速冻并保存于-80℃超低温冰箱中备用。

　　1.2 基因组DNA提取及检测

　　参照王军等的改良CTAB法进行基因组DNA的提取，材料选取葡萄的幼嫩幼叶，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，利用Bio-Photometer核酸检测仪（德国Eppendorf公司）检测提取的DNA溶液浓度与纯度，根据检测结果将DNA溶液终浓度稀释至20 ng/μL。于- 20℃ 保存备用，原浓度DNA保存于- 70℃冰箱中。

　　试验参照葡萄公共遗传图谱数据库中公布的44对SSR引物进行筛选分析， 并最终确定15对引物应用于本研究，引物序列信息见表2，所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

　　1.3 PCR扩增

　　SSR 引物来源于葡萄公共遗传图谱NCBI及参照文献对葡萄19条染色体上分布的引物共44对进行筛选，最终筛选到15条引物用于本项研究（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增反应体系：总体系10μL，其中包括模板DNA20ng，PCR Mix 5 μL，引物各0.4μL，Taq DNA聚合酶1 U，ddH2O3μL。扩增程序：94℃ 预变性5min；94℃ 变性30s，52~60℃ 退火30s，72℃ 延伸90s，35个循环；72℃ 延伸10min，反应产物保存于4℃ 用于检测。

　　1.4 扩增产物的检测

　　采用毛细管电泳法进行条带检测分析。

　　1.5 数据统计及分析

　　将扩增图片进行SSR标记的数据统计，数据编码采用(1，0)矩阵，即将有带记为1，无带记为0。根据0/1数据矩阵统计结果，利用NTSYS-pc2.10软件计算不同样本间的遗传距离，用公式P=( k/n)×100% 计算多态性位点的百分率，其中k 为多态位点数，n为所测位点总数。任意2 个品种（系）间的遗传相似系数(Genetic similarity，GS)利用NTSYS中的Qualitative date模块计算。计算公式为GS=2Nij/(Ni +Nj) ，其中Nij 为供试材料i 和j 共有的扩增片段总数，Ni 为供试材料i中出现的扩增片段数，Nj 为供试材料j 中出现的扩增片段数。并利用软件中Qualitative Date功能计算不同样本间的遗传相似系数，采用非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析，通过多态性谱带的有序编码转换，构建品种的分子身份证系统。

　　赋值标准为：

　　（1）1 5位1 0进制数字（0 -9），分别对应1 5条SSR引物；

　　（2）每个材料、每个引物扩增的条带按大小增序排列，ID的数字表示该扩增条带大小在该引物所有条带中的次序；

　　（3）如果某引物无扩增或者扩增条带过多，10个以上的条带都赋值为0；

　　（4）如果存在某引物在一个样品中同时扩增多个条带，只取较小的条带次序作为该样品该引物的ID。

　　2　结果与分析

　　2.1 SSR 引物筛选及多态性分析从44对SSR 引物中筛选出多态性好，条带清晰的15对引物，合成荧光引物用于葡萄材料的SSR 扩增（表2）。15对引物扩增的谱带清晰，且多态性丰富。 单条引物扩增的条带为2-8条，平均4.93条。扩增产物长度介于164-287bp，以170-260 bp的扩增片段居多。扩增条带数最少的引物为Scu04vv，Scu16vv，VVMD19，均只扩增出2条条带；扩增条带数最多的引物为UDV-134与VMD5，为8条（表3）。15对引物共扩增出74 条带，其中71条为多态性条带，多态性百分率为95.9% 。

　　2.2 不同酿酒葡萄种质的遗传距离分析

　　本研究根据0/1数据矩阵统计结果，对不同样本间的遗传距离进行了计算，具体结果见表4。15个酿酒品种中，两两遗传距离在0-1.0924之间，其中公酿1号和柔丁香之间遗传距离最远，为1.0924；梅露辄181和梅露辄343之间遗传距离为0，距离最近，所用引物未能将其分辨出来。

　　2.3 不同酿酒葡萄种质的SSR聚类分析

　　以各品种15对引物的扩增带型为基础，以0 、1 格式表示，用NTSYS软件进行UPGMA 法聚类分析得出15份葡萄的聚类图（图1）。结果显示：各品种间遗传相似系数范围为0.63~1.00。以遗传相似系数0.755 为标准，可将所有供试材料分为5 个类群：A 、B 、C 、D 、E 五类。供试的 15份材料在遗传相似系数 0.63处产生了分离（图1），可以将所有15份材料分成两大类，第一个大类包含有3个品种，“公酿1号”“公酿2号”“左山”，其特点为均为我国自育的山欧杂种或山葡萄，占全部供试材料的20%；第二大类中，可分为4个小类，“柔丁香”一个欧美杂种类型单独一组，其余均为欧亚种，“小白玫瑰”与“玫瑰香”在一次级分支上，均为玫瑰香型品种；“赤霞珠”“梅鹿辄181”“梅鹿辄343”分在一组。但值得注意的是“公酿1号”“公酿2号”两个品种，其母本为“玫瑰香”，父本为“山葡萄”，遗传表现为与左山相对较近，与“玫瑰香”表现较远。

　　2.4 酿酒葡萄种质分子身份证号码

　　根据各引物对品种的扩增结果和等位基因的赋值标准，对15份种质赋值，结果显示，其中的13份具有特异的分子身份证编码，梅鹿辄品种的两个单系181与343不能有效区分，但公酿1号与公酿2号，黑比诺的两个芽变品种灰比诺与早比诺均能有效区分。

　　3　讨论

　　与RAPD、RFLP、AFLP、ISSR等分子标记技术相比，SSR 分子标记可直接反映研究材料本质上的差别，检测到DNA分子结构的变异，检测所需DNA量少且速度快，信息量大，标记呈共显性。因此，其在物种起源、演化和遗传变异研究中得到了广泛的应用。利用该技术进行分子身份证研究也取得了一定进展，在水稻、大豆、甘蔗、桃等许多材料上均有报道，在葡萄品种鉴定、分析种质间的遗传多样性、品种间的亲缘关系等方面，多利用RFLP、RAPD 等其他分子标记技术进行研究，但应用SSR 标记进行葡萄种群间亲缘关系的研究及进行分子身份证的建立研究相对较少。Botta等利用4 对引物对意大利的24个葡萄品种（系）进行了鉴定，可将其中21个品种（系）区分开；Bowers等应用SSR 技术将赤霞珠(Cabernet sauvignon)的父、母本分析了出来；在分子水平对酿酒葡萄品种系谱关系、遗传多样性、砧木资源等方面的研究也在逐渐增多。

　　本研究利用SSR 标记对15份葡萄种质资源进行了亲缘关系研究，所得结果与品种的系谱基本一致。聚类分析结果显示，供试的 15份材料在遗传相似系数 0.63处产生了分离。在遗传相似系数 0.63处可以将所有15份材料分成两大类，第一个大类包含有3个品种，“公酿1号”“公酿2号”“左山”，其特点为均为我国自育的山欧杂种或山葡萄，占全部供试材料的20%；第二大类中，“柔丁香”一个欧美杂种类型单独一组，其余均为欧亚种，“小白玫瑰”与“玫瑰香”在一次级分支上，均为玫瑰香型品种；“赤霞珠”“梅鹿辄181”“梅鹿辄343”分在一组。但值得注意的是“公酿1号”“公酿2号”两个品种，其母本为“玫瑰香”，父本为“山葡萄”，遗传表现为与左山相对较近，与“玫瑰香”表现较远。聚类结果说明，分子标记分析的亲缘关系与其亲本有一定的关系，但取决于其遗传力，SSR 能比较准确地检测基因型之间的遗传背景与遗传关系。本研究选用的15个不同酿酒品种材料具有较强代表性，分别代表了我国自育的抗寒品种、国外优良酿造红葡萄酒类型、白葡萄酒类型、鲜食酿酒兼用类型等不同类型种质；而SSR引物多态性反映不同种质的多态性，本研究所选SSR引物为国际通用的44对引物中筛选的15对多态性好的引物，也具有代表性。在国内外相关研究中，郭春苗等的研究主要集中于新疆制干品种（系）进行遗传多样性分析及指纹图谱构建，均为鲜食且多为无核品种；樊秀彩等的研究对象为山葡萄和河岸葡萄种间杂种；方连玉、吴子龙等的研究为山葡萄、山欧杂种及部分欧亚种，欧美杂种品种和美洲杂种品种；成冰等的研究利用14对引物研究了13个酿酒白葡萄品种的遗传多样性分析，Fregoni M的研究涉及的虽然为为酿酒葡萄品种的多态性研究，但仅选用6个品种，关注点主要在发酵及酒的研究，且均未涉及分子身份证研究。尹玲等的研究为我国近几年新选育的鲜食品种的SSR指纹图谱构建，选择的几个酿酒品种作为对照；我们的研究基于国家葡萄产业体系加工品种选育岗位保存的丰富的酿酒葡萄种质资源，研究目标更加明确。

　　就本研究建立的15个酿酒葡萄种质的分子身份证而言，其中的13份具有特异的分子身份证编码，虽然将两个近缘品种公酿1号与公酿2号，黑比诺的两个芽变品种灰比诺与早比诺有效区分开来，但梅鹿辄品种的的两个单系181与343却不能有效区分，因此还需进一步开发新的SSR分子标记用于葡萄种质分子身份证系统的建立。同样，对于芽变品种灰比诺与早比诺，有7对引物间存在差异，公酿1号与公酿2号，有8对引物间存在差异，开发理想的核心分子标记引物工作也是今后研究的一个方向。