加工研究室 酿酒微生物岗位

　　氮源是影响葡萄酒酒精发酵进程及酒的感官质量的重要因素，主要通过影响酿酒酵母的生长及代谢途径来实现的(Bisson 1991)。氮源的浓度和种类能够在很大程度上影响发酵速率及酒精发酵完成情况，在氮源浓度过高或过低时这种影响表现得尤为明显。氮源浓度过高，酒精发酵旺盛，易产生不良物质（如：氨基甲酸乙酯）(Ough etal. 1988)，进而影响发酵进程及酒的感官质量；氮源浓度过低，会引起发酵迟滞甚至终止，并伴有不良气味的产生，如H2S(Ugliano et al.2007)。因此，研究不同氮源浓度对葡萄酒发酵进程的影响，对于最大限度发挥酿酒酵母的发酵潜力，提高发酵质量意义重大。

　　1　酵母利用氮源的种类及含量

　　葡萄汁中的含氮物质分为有机态氮和无机态氮。其中有机氮主要有氨基酸、多肽和蛋白质，尿素、尿囊素（allantoin）等(Fermentativaet al. 2011)。无机氮主要有硝态氮和铵态氮。在酒精发酵过程中，酿酒酵母可吸收利用的含氮物质统称为酵母可同化氮（Yeast AssimilableNitrogen, YAN），主要由游离α-氨基酸（除脯氨酸）、铵态氮、小分子多肽及蛋白质组成(Henschke etal. 1993)。

　　酿酒酵母能够利用的含氮物质超过50种，但存在对特定物质的优先利用现象。经研究，大多数酵母菌会优先利用铵盐、谷氨酰胺、天冬氨酰这三种氮源。下一组被优先利用的含氮物质包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、尿素和精氨酸(Ter Schure et al.2000)。

　　由于许多因素的互相影响及不同实验方法导致的结果差异，关于葡萄酒酿造过程中所需YAN的含量，只能得出一个大概的估计范围为70-267 mg/L，这其中不同的酵母菌株对YAN的需求差异尤为明显(Blateyron et al. 2001)。在实际生产中，在含有适量糖的澄清葡萄汁中的YAN含量不应低于140 mg/L。

　　（1）铵盐

　　铵盐是最易于被酵母菌优先利用的氮源之一，因为其可以被酵母直接代谢吸收(Bisson 1991)。酿酒葡萄汁中的铵盐含量受到葡萄品种、栽培条件及酿造工艺的影响。研究显示，葡萄中铵盐的含量的变化范围大概在 5～325 mg N/L(Barreet al. 1991)。检测同一区域所栽种的不同的葡萄品种的铵盐含量发现，赤霞珠葡萄中铵盐占 YAN 的53%，而琼瑶浆中铵盐只占到 YAN的 32%，大体来讲，葡萄采收时铵盐占到总 YAN 的 2%～53%(Huanget al. 1989)。总体而言，不同品种的葡萄汁中铵盐含量占到总酵母可同化氮源的40%(Beltran et al.2005)。

　　（2）氨基酸

　　氨基酸是又一大重要的氮源物质来源，对葡萄酒的酿造过程及葡萄酒的风味形成具有重要影响(Mauricio et al. 2001)。葡萄汁中含有多达32种氨基酸(Bisson 1991)，主要的含氮物质为脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸及谷氨酰胺(Pretorius 2000)，其中L-脯氨酸和L-精氨酸含量占到总氨基酸的30%-65%(Henschke et al.1991)。而可被酵母利用的氨基酸是总氨基酸中的重要组成部分，到葡萄采收时可被利用的氨基酸含量会占到酵母可同化氮源的51%～59%(Conradie 2001)。

　　葡萄酒中的氨基酸种类和含量主要受到葡萄品种、栽培条件（包括施肥情况、气候、土壤等）以及酿造工艺等因素的影响(Rizzon 1985)。有研究分析检测了2010年新疆产区14种酿酒白葡萄品种的氨基酸组成，发现不同品种葡萄中17种氨基酸总量差异显著，其范围为1128.550（灰司令）-4967.779mg/100g（白比诺）(成冰等 2013)。另有研究发现，我国四个葡萄酒产区的不同葡萄品种中，烟台的蛇龙珠、昌黎的赤霞珠、宁夏的梅鹿辄和赤霞珠中氨基酸总量较高，平均含量为79592.43μmol/L；在酒精发酵过程中，丝氨酸、精氨酸、苏氨酸及谷氨酰胺能被优先快速利用；天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸在酒精发酵旺盛期基本被消耗；脯氨酸、鸟氨酸、甘氨酸、赖氨酸及羟脯氨酸基本不被利用(高年发等 2011)。另有研究表明，酿酒酵母吸收利用最多的氨基酸是精氨酸，之后是苯丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、赖氨酸及甲硫氨酸，大多数氨基酸在酵母的对数生长期被消耗殆尽，但有少数氨基酸（如：组氨酸和天冬酰胺）直到发酵结束都有被继续利用的现象Barrajón-Simancas et al. 2011)。总体而言，不同氨基酸被酵母吸收利用的情况不同，但氨基酸在酵母可同化氮源中有着重要的地位。

　　2　氮代谢及其调控机制

　　酿酒酵母利用氮源物质要经过一系列转运合成过程，一般是通过特定的酶将氮源转运至细胞内，之后这些含氮化合物既可以直接进入蛋白质的合成途径，也可以通过降解成谷氨酸或氨，再重新进入生物合成途径(Cooper 1982)。

　　酿酒酵母主要的氮同化作用途径如下图(Ter Schure et al. 2000)：当酿酒酵母在含有丰富的氨或可相应转化为氨的氮源上生长时，主要发生反应(1)，生成的谷氨酸会接着和NH4+合成谷氨酰胺，发生反应(2)。反应(3)在此条件下不会发生(杨瑞娟等 2008)。与酿酒酵母相比谷氨酸会优先利用谷氨酰胺及铵盐的研究结果一致。在合成谷氨酸方面，通过反应（2）与（4）的协作，可组成由α-酮戊二酸和氨态氮的不依赖于反应（3）的合成谷氨酸的通路。由以上反应可知，任何能够被转运并被代谢生成谷氨酸或铵盐类物质的含氮化合物，都能够作为酵母的唯一氮源(张伟平等 2012)。并且当非优先利用氮源，作为酵母细胞的氮源时，其全部都用来合成谷氨酸和谷氨酰胺。

　　因此，谷氨酸盐与谷氨酰胺作为酵母细胞内的主要信号物质，会引起一系列与氮相关合成途径的激活与抑制，同时也会受到其他途径的调节。

　　当环境中可以被酵母优先利用的氮源不足或已被完全利用时，酿酒酵母会开始利用脯氨酸、精氨酸等贫乏型氮源(Ter Schure etal. 2000)。这种由缺乏优先利用氮源而引起的，氮源对贫乏型氮源在转录水平上的去阻遏现象，被称之为氮代谢阻遏调控（NitrogenCatabolite Repression, NCR）(张伟平 等 2012)。氮源代谢阻遏调控实质就是在环境中的氮源不足时，酵母通过增加相关酶的表达量来合成谷氨酸及谷氨酰胺，从而通过增加透过酶的活性，促进非优先利用氨基酸被酵母吸收利用的一种调节方式。氮代谢阻遏调控以及Ssy1p-Ptr3p-Ssy5 (SPS)等均可实现酵母对氮源的选择及吸收利用的调控。

　　总之，在葡萄酒酿造过程中氮源的种类和含量会影响酵母菌对氮源的吸收和利用，从而影响酵母菌的生长情况。

　　3　氮源对酿酒酵母发酵性能的影响

　　（1）氮源含量对酿酒酵母发酵性能的影响

　　氮源含量对葡萄酒酿造过程的影响体现在，随着葡萄汁中 YAN含量的增高，酵母的生物量会相应增加，在其他发酵相关条件都处在最佳状态时，发酵速率会提高同时发酵总的时间会减少(Beltran etal. 2005, Spring 2003, Cramer et al.2002)。也就是说，在其他发酵条件都处在最适状态时酵母菌株生长情况和其发酵能力呈正相关关系(Cramer et al. 2002)。但也有研究通过测定糖的代谢速率或者 CO2的释放速率来确定发酵速率， 发现在发酵初期发酵速率和酵母的生物量呈正相关，但是在发酵后期即酵母停止生长的时期，发酵速率与酵母生物量就没有直接的关系。一般来讲，酵母的生物量与葡萄汁中初始的 YAN量成正比关系。但是这个相关关系还受很多因素影响，包括酵母菌株、酵母对氮源的需求、氮源的类型、葡萄的固形物含量、氧气供应、发酵温度等(Blateyron et al. 2001, Butzke et al.2011, Cramer et al. 2002)。其中，酵母菌株的影响尤其明显。不同菌株对氮源的利用情况的差异，造成不同的酿酒酵母即使在同一氮源水平下时，其酵母的生物量及其发酵进程也存在一定差异。

　　由以上可知，当其他条件合适时，最大的发酵速率，最大的 CO2释放速率，发酵持续的时间与初始的 YAN 含量存在一定的相关关系。有研究发现，当初始YNA的含量过低时，在开始时发酵过程一切正常，而在糖被消耗完全之前，则会逐渐的出现发酵速率下降甚至停止的现象。但也有研究发现，有些酵母在发酵初期氮源十分充足的情况下，再度添加氮源，即增加YAN含量不会加快酵母的生长速率，从而加快发酵进度(Taillandieret al. 2007)。对此现象有一种解释是，氮源主要影响糖的消耗速率，而对菌体生物量的影响较弱，糖消耗速率与初始的YAN含量存在比例关系，并且最适的YAN浓度可以使糖消耗速率达到最大，即发酵速率达到最大，但当氮源水平过饱和时则不存在对应关系，并且还会抑制发酵过程的进行(Taillandier et al.2007)。

　　（2）氮源种类对酿酒酵母发酵性能的影响

　　在酒精发酵过程中，不同种类的含氮化合物会对酿酒酵母的生长及代谢造成不同的影响，会在一定程度上改变酿酒酵母的发酵特性，并生成不同的代谢产物。因为不同的氮源会激活或重组酿酒酵母不同的氮代谢途径(Clement et al.2013)。

　　向酒中补加的氮源一般为铵盐（如磷酸氢二铵、氯化铵等）以及氨基酸，但是添加单一铵盐会导致无机氮和有机氮之间的比例不协调，进而会影响酵母对氨基酸的吸收及代谢。有研究发现，单一添加铵盐会影响精氨酸以及丙氨酸的吸收，进而促使酵母吸收利用谷氨酰胺、芳香族氨基酸及支链氨基酸(Jiménez-Martí et al. 2007)。但有研究指出，添加磷酸氢二铵（DAP）确实可以明显缩短发酵的时长，但比生长速率及酵母生物量不会有明显的增高(Pereira et al. 2015)。

　　另外，向酒中添加氨基酸会缩短发酵时长，增加CO2生成速率，并对pH以及酒精含量有显著影响(Hernández-Orte et al. 2006)。

　　综上所述，在葡萄栽培和葡萄酒酿造过程中，关注葡萄氮素素营养及葡萄酒发酵过程中酵母菌的氮素需求及合理的氮源供给，对葡萄酒质量的提升具有积极的作用。