病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤 张尊平 任芳

　　1984年于日本巨峰葡萄上首次发现葡萄浆果内坏死病（最早称花叶病），该病在日本山梨县葡萄园造成严重危害。一些敏感品种（如巨峰、先锋、立川无核、康拜尔早生）受到该病毒侵染后，植株生长减弱，春季萌芽延迟，并且表现茎内坏死、短节、花叶、果粒小，果外变色，果内坏死等症状。葡萄浆果内坏死病能在田间通过未知介体自然传播。病株摩擦接种 诺藜后，发现了一种大小为740×12 nm的线形病毒，命名为葡萄浆果内坏死病毒（Grapevine berry inner necrosisvirus, GINV），其粒子大小、形态特点与发状病毒属（Trichovirus）的代表种苹果褪绿叶斑病毒（Applechlorotic leaf spot virus , ACLSV）类似。1997年日本岩手大学（IwateUniversity）Yoshikawa等测定了GINV的3’端2469个核苷酸序列（含3个阅读开放框），通过序列比对分析，明确了GINV为发状病毒属的一个新病毒。

　　为了明确病原，我们采用小RNA测序技术对两个表现环斑症状的安尼斯基和贝达葡萄样品（图1）进行了病毒鉴定，在两个样品中均检测到葡萄浆果内坏死病毒（Grapevine berry inner necrosisv i r u s, GINV）。除此之外，安尼斯基葡萄上还检测到葡萄卷叶相关病毒3（Grapevine leafroll-associatedv i r u s 3, GLRaV-3）、葡萄黄斑类病毒1（Grapevine yellow speckle viroid1 , GYSVd-1），葡萄黄斑类病毒2（Gr a pe vi n e yell ow s p ec k l e vi r o i d 2,GYSVd-2)和啤酒花矮花类病毒（Hop stunt viroid, HSVd）；贝达样品中检测到HSVd。表现环斑症状的安尼斯基葡萄样品先前通过PCR的方法对葡萄卷叶病毒1,2,3,4,7（GLRaV-1,2,3,4,7）、沙地葡萄茎痘病毒（GRSPaV）、葡萄斑点病毒（GFkV） 、葡萄病毒A（GVA）、葡萄病毒B（GVB）、葡萄病毒E（GVE）、葡萄扇叶病毒（GFLV）等主要葡萄病毒进行了检测，同时采用ELISA方法对番茄环斑病毒（ToRSV）、南芥菜花叶病毒（ArMV）、草莓潜隐环斑病毒（SLRSV）等一些线虫传多面体病毒进行了检测，结果仅检测到GLRaV-3，未检测出其他病毒。本研究所使用的贝达葡萄样品也经检测不带有上述病毒，但种植在田间2年后被发现表现环斑症状。据报道，与环斑症状可能相关的病毒为GFLV或其他一些线虫传多面体病毒，然而在这两个样品中均未检测出相关的病毒，另外，GLRaV-3、HSVd 、GYSVd1和GYSVd2属于葡萄上常见的病毒和类病毒，其中，GLRaV-3与葡萄卷叶病的发生相关，而HSVd 、GYSVd1和GYSVd2通常在葡萄上不表现症状，因此，初步排除了这些病毒和类病毒与环斑症状发生的相关性。由于GINV在两个表现症状的葡萄上均被检出，而在不表现症状的贝达葡萄上未发现，因此，GINV很可能与上述两个品种葡萄环斑症状的发生相关。

　　对贝达葡萄样品中的GINV分离物全长基因进行扩增，结果获得了一个GINV分离物LN-BETARS全长序列（Genbank登陆号为KU234316），该分离物基因组含7229 bp碱基，同样编码三个主要的阅读框，包括复制酶（100-5697nt）、移动蛋白（5630-6652 nt）和外壳蛋白（6561-7148 nt）。中国GINV分离物LN-BETA-RS与日本分离物（D88448）的核苷酸/氨基酸同源性较高，而与其他发状病毒属成员的同源性均较低。GINV分离物LN-BETA-RS和日本分离物（D88448）的RP、MP和CP基因的氨基酸比对结果显示，RP基因变异最大，主要集中在575-612 aa和651-667 aa的位置。MP基因的氨基酸序列差异主要在靠近3’端的位置，而CP基因的氨基酸序列差异较小。

　　综上所述， 本研究采用小RNA测序技术在我国首次发现了GINV，初步的结果表明GINV可能与环斑症状相关。另外，通过对贝达中的GINV分离物进行全长基因组测定，获得了一个GINV中国分离物全长序列，序列分析结果表明该分离物属于一个新的GINV分子变种。