寒区品种选育岗位
郭印山 郭修武 李坤 刘镇东 李成祥
葡萄品种资源指纹图谱构及亲缘关系分析对葡萄育种、种质资源管理及其保护具有重要意义 。葡萄在形态结构，经济特征和抗逆性方面有极其丰富的变异，这使得传统的根据形态特征来进行葡萄的分类鉴定越来越受到限制。SSR分子标记是建立在PCR基础上的一种DNA分子标记，它为共显性遗传，多态性高，可在分子水平分析种质资源的遗传多样性，用于葡萄资源遗传多样性的分析已多有报道。例如张萌等利用8对SSR引物分析了安徽黄山地区40份野生刺葡萄资源的遗传多样性，结果表明刺葡萄的基因流限制于短距离，黄山地区的刺葡萄主要以有性繁殖为主；温景辉等曾用18对SSR引物对360份山葡萄资源进行了遗传多样性研究，结果表明我国山葡萄种质资源遗传多样性极为丰富。目前，SSR标记广泛应用于遗传多样性和品种的评估，本研究利用SSR标记技术，从分子水平探讨15份葡萄资源的遗传多样性，构建了指纹图谱，为有效利用DNA标记评价葡萄种质资源提供理论基础。
1 材料与方法
（1）试验材料
试验材料取自沈阳农业大学葡萄品种资源圃。选取15份葡萄品种，包括：金星无核、火星无核、康可、无核白鸡心、红宝石无核、玫瑰香、意大利、京玉、赤霞珠、雷司令、霞多丽、北冰红、左优红、双优、双红（分别编号1-15）。
（2）基因组DNA的提取与检测
参照王军等的改良CTAB法，从葡萄幼叶中提取基因组DNA。DNA浓度和质量的检测采用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测和NanodropND-2000核酸蛋白仪测定。将浓度稀释至30ng•μL-1置于-20℃冰箱保存备用。
（3） SSR扩增
PCR反应为16 ul的反应体系，包括10 ng的DNA，Mgcl22.0 mM，dNTPs100 μM，每对引物各0.3μM，1×PCR buffer，Taq DNA聚合酶0.8 U。采用S1000TM PCR仪进行扩增。扩增的程序为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，退火1min，72 ℃延伸1min，进行25个循环；最后72 ℃延伸7 min。扩增产物在5 % 的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，银染染色。PCR试剂购自北京赛百盛生物公司，引物由北京鼎国生物技术公司合成。
（4）数据统计
电泳图谱的每条带均为一个分子标记，代表一个引物的结合位点。按照条带的有无，统计所有的二元数据，有带记作1，无带记为0。根据二元数据计算多态性位点百分数，采用NTSYS统计分析软件对数据进行分析，品种间的相似系数按Jaccard公式计算，以非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析，并建立遗传关系图。
2 试验结果
（1）引物的多态性分析从245对引物中筛选出了49对条带清晰、多态性丰富的引物用于15个葡萄品种的遗传多样性研究。单条引物扩增出的条带数为2~9条，平均4.79条。共扩增出235条带，片段大小均在100bp到500bp。多态性条带的百分率为100%。由此可见，SSR分子标记技术检测葡萄遗传多样性的效率很高，也表明供试葡萄资源间的遗传多样性较为丰富。
（2）指纹图谱的构建
根据SSR标记数据，我们以2对引物为基础，构建了15个葡萄品种的指纹图谱。引物编号分别为VMCNG4B9、VMC3G9。引物VMC3G9扩增中，北冰红、康可、双优、左优红、双红等品种具有特殊的带型，能很好地与其余的种质区分开。引物VMCNG4B9扩增中，金星无核、火星无核、无核白鸡心、赤霞珠、双优、雷司令、左优红等品种具有特殊的带型。综合2个引物的SSR数据，15份葡萄品种的SSR指纹图谱互不相同，可以为品种鉴别提供依据。
（3）15个葡萄品种的聚类分析
图2 为基于SSR分子标记的15个葡萄品种聚类关系图，从图2中我们可以清晰的看出来，所采用的15份葡萄材料的遗传相似系数为0.660~0.860，平均遗传相似系数为0.760。在遗传相似系数为0.672处时，15份葡萄材料可以分为3大类群。
第1大类包括3份葡萄资源：2份欧美杂种品种（金星无核和火星无核）和一份美洲种品种（康可）。当遗传相似系数为0.800的时候，金星无核和火星无核这两个品种聚为一类。在遗传相似系数为0.721处，康可与金星无核、火星无核聚为一类。
第2大类包括8份欧亚种葡萄品种（无核白鸡心、红宝石无核、玫瑰香、意大利、京玉、赤霞珠、雷司令和霞多丽）。当遗传相似系数为0.727的时候，该群分为两个亚群：鲜食葡萄和酿酒葡萄，前者包括白鸡心、红宝石无核、玫瑰香、意大利和京玉；后者包括赤霞珠、雷司令和霞多丽。在鲜食葡萄中，京玉葡萄是意大利与葡萄园皇后的杂种后代，所以京玉和意大利的遗传相似系数最大，为0.838。玫瑰香作为意大利的亲本，在遗传相似系数为0.826处，玫瑰香和意大利，京玉聚为一类。在酿酒葡萄中，当遗传相似系数为0.792的时候，雷司令和霞多丽聚为一类。在遗传相似性系数为0.755处，赤霞珠和雷司令，霞多丽聚为一类。第3大类包括2份山欧杂种（北冰红、左优红）和2份山葡萄（双优、双红）。当遗传相似系数为0.808的时候，双优、双红聚为一类。而左优红、北冰红在遗传相似系数为0.769的时候，与山葡萄聚为一类。试验表明，山欧杂种与山葡萄有较近的亲缘关系。
3 小结
本研究以包括美洲种、欧亚种、山葡萄、山欧杂种、欧美杂种的15个葡萄品种资源为试材，利用2 对引物（VMCNG4B9和VMC3G9）建立了15份葡萄品种的指纹图谱，显示了SSR标记在品种鉴定方面有高度的辨别能力。并利用SSR标记探讨葡萄种群的亲缘关系，结果表明在遗传相似系数0.672处可分为3大类群。第1类包括2份欧美杂种葡萄品种和1份美洲种葡萄品种；第2类包括8份欧亚种葡萄品种；第3类包括2份山欧杂种葡萄品种和2份山葡萄品种，证明了葡萄种群的形成与其起源的地理气候特征密切相关。