虫害防控岗位

王琦　程玉琴

　　将赤霞珠和夏黑葡萄组培苗用常规RT-PCR法检测葡萄卷叶伴随病毒2号(grapevine leafroll-associatedvirus 2, GLRaV-2)，发现该病毒检出率为60%左右。由于检测的这两个品种葡萄组培苗均分别由同一母株快繁而得，因此这近一半样品未检测出病毒是一种假阴性结果。出现假阴性检测结果有三方面原因：一是由于葡萄组织培养阶段植物细胞中的病毒含量较低；二是GLRaV-2特异分布于韧皮部，而我们是以组培苗叶片作为样品来提取总RNA而不是韧皮部组织中提取，从而导致病毒浓度低；三是常规RT-PCR法检测灵敏低较低。为了提高在葡萄组培苗进行病毒检测的灵敏度，本岗位建立了检测GLRaV-2的实时荧光(Quantitativereal time) RT-PCR方法。

　　1　实验材料、试剂与用具

　　1.1　植物材料

　　葡萄组培苗叶片

　　1.2　试剂

　　EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒（百泰克公司）、反转录试剂盒（PrimeScript® RT reagentKit, TaKaRa）、SYBR Green PCR试剂盒子（SYBR® PrimeScriptTMRTPCRKit，TaKaRa)、GLRaV-2 qPCR检测引物（根据GLRaV-2 CP蛋白基因序列设计， 正向引物：5'-CCTGGTGATAACTGACGCCTC-3'，反向引物：5'-GTAGACCGAACACCACTTCTATACCG-3'；浓度为20μM）、双蒸水（ddH2O）、液氮。

　　1.3　用具

　　荧光PCR仪（ABI 7500 FastReal-Time PCR System，AppliedBiosystems)、微量台式冷冻离心机、涡旋混合器、微量紫外/可见分光光度计、微波炉、天平、灭菌锅、移液器、研钵、1.5 mL离心管、0.2 mL离心管、Tip头、一次性手套和口罩。

　　研钵、1.5mL 离心管、0.2mL离心管和Tip头须在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

　　2　实验方法

　　2.1　总RNA提取

　　称取0.1 g~0.2 g组培苗叶片放入研钵中，加入液氮，将其研磨成粉末。将粉末转移到1.5 mL离心管，按照试剂盒（EASYspin 植物RNA 快速提取试剂盒）的操作步骤提取总RNA。用微量紫外/可见分光光度计测定RNA浓度。

　　2.2　反转录

　　将反转录试剂盒（PrimeScript®RT reagent Kit, TaKaRa）中组分及提取的RNA按表1所示加入1.5 mL离心管，混匀：将离心管放在37℃ 恒温水槽中1 小时（h）后获得cDNA。

　　2.3　PCR扩增

　　将cDNA稀释成107倍后用于qPCR。在离心管中加入下列组分：10μl SYBR Premix Ex Taq、1 μl稀释成107倍的cDNA、正向反向引物(20μM)各0.2μl、0.4μlROX Reference DyeII (稀释50倍)、8.2μl ddH2O。混匀后将离心管放在荧光PCR仪进行反应。PCR 反应条件： 95℃ 预变性 30 s；95℃ 变性 5 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸30 s，40 个循环（在72℃收集荧光信号）。反应结束后取出。

　　2.4　数据分析

　　分析溶解曲线是否是单峰，如果是，表明是特异性扩增，实验结果有效。在该基础上再分析循环阈值（threshold cycles，CT)，CT大于等于38视为阴性样品，否则为阳性。

　　经分析，我们所建立的qPCR法具有良好的特异性，只出现了单峰（图1）。且所检测9个赤霞珠和12个夏黑样品的CT均小于38（表2 ） ， 表明这些组培苗均感染了GLRaV-2，与我们预期结果一致。该方法可广泛用于葡萄脱毒苗的检测。