鲜食品种选育岗位

王慧玲 闫爱玲 孙磊 孙晓荣 徐海英

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　本研究所用材料均为北京市农林科学院林业果树研究所选育的优新品种，共13份（见表1），分别种植于所内资源圃和温室。在四月中旬采集各个葡萄品种幼叶液氮速冻，保存于-80℃冰箱，用于基因组DNA的提取。

　　1.2　基因组DNA提取

　　基因组DNA提取参照Marsal等的方法。从葡萄幼叶中提取基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用Eppendorf公司生产的Bio-Photometer核酸检测仪检测DNA溶液的浓度与纯度，并将浓度稀释至50 ng/μl。

　　1.3　DNA扩增和电泳

　　本研究选取9 对国际通用的SSR引物进行扩增（表2），其中6个标记（VVMD5、VVMD7、VVMD27、VVS2、VRZAG62及VRZAG79）曾被This等[19]推荐为葡萄品种筛选的核心标记。引物由上海生工合成，每对引物合成2OD，-20 °C冰箱保存备用。

　　DNA扩增采用2 0 μ l 体系。其中含：10×PCR buffer，引物0.25μM，模板DNA 50ng，dNTP0.2mM，rTaqDNA 聚合酶0.5U。用于SSR-PCR 反应的dNTP、Taq酶、DNA Marker 购自Takara公司。

　　PCR扩增程序: 9 5 ℃ 预变性5min，95℃变性15s、65℃～55℃退火15s、72℃延伸1 min、10个循环，95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸1 min，25个循环，4℃保存。PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的9600 Thermal Cycler型PCR仪上进行。然后取PCR产物4 μl进行点样，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，胶干后在清华紫光e100扫描仪上成像保存。

　　1.4　数据分析

　　采用P o w e r m a r k e r 软件（Version 3.25）对9个SSR标记的遗传多样性指数进行分析。数据标准化处理方法参考陈昌文等[11]的方法。根据每对引物对不同种质扩增片段对应的分子量大小，按从小到大依次编码为1-8。同时参考桃分子身份证的构建方法，当引物扩增的某一品种等位基因有2个时，按等位基因碱基数较小的条带编码进行赋值。并通过非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立亲缘关系图。

　　2　结果和分析

　　2.1　SSR引物扩增多态性

　　通过改进的CTAB方法提取全部试验材料的基因组DNA，通过电泳和紫外分光光度计检测，基因组DNA的浓度和纯度均符合SSR实验要求。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，SSR扩增条带清晰。本实验所选用的9对SSR引物在供试葡萄品种中共检测到48个等位基因，平均每对引物扩增的等位基因数是5.3个。最少的VVMD6和VrZAG29引物分别扩增出3个等位基因，VrZAG79扩增的等位基因数最多为8个，其中有5对引物的等位基因数超过平均数（表2）。等位基因数越多，表明该引物更能反应品种之间的差异。其中VVMD5和VVMD7对13个品种扩增结果见图1，显示13个品种分别有6个等位基因。尽管9对引物的多态性不高，但是足以区分这13个葡萄品种。

　　利用Powermaker软件对9个SSR标记在13个葡萄品种中的主等位基因频率、期望杂合度、观测杂合度及扩增位点的多态信息含量等进行了计算分析（表3）。扩增位点的观测杂合度在0.385-0.846之间，平均值为0.641。期望杂合度的范围在0.435-0.811之间，平均值为0.638。多态性信息含量PIC变幅为0.401-0.784，平均为0.598。VrZAG79引物的PIC值最高，结合期望杂合度值及等位基因数值，该引物对本研究供试葡萄品种的区分能力最强。

　　2.2　分子身份证构建

　　根据电泳结果，对9对引物在供试种质扩增的等位基因谱带大小分布范围进行赋值。因为本实验中引物扩增最多等位基因数为8，所以赋值范围为1-8（表4）。为了保证分子身份证字符串的每位上只有1个字符，对同一引物下的扩增条带只选择位点较小的进行分子编码。

　　根据表4中等位基因的赋值标准和各引物对品种的扩增结果，对13份供试葡萄品种进行分子编码，结果显示，用选取的9对引物可以将13个品种进行有效区分。但是因为品种亲缘关系较近，进行分子编码最少也需要8对引物才能够将所有品种区分开（表1）。瑞都红玫和瑞都早红的分子编码比较相似，在第8对引物时才区分开。另外在所构建的13个品种分子身份证中，有7个品种具有至少一个特异等位基因。紫珍珠、早玫瑰香和瑞都脆霞各具有一个特异等位基因，艳红、早玛瑙和峰后各具有2个特异等位基因，瑞都无核怡则具有3个特异等位基因（表1）。

　　2.3　供试葡萄品种亲缘关系分析

　　根据文中所用的9 对S S R 引物扩增结果进行数据统计， 利用POWERMAKER软件， 采用UPGMA法对所有品种进行聚类分析，结果如图2所示。聚类结果显示，亲缘关系近的多聚为一类，如父母本相同的瑞都红玫、瑞都早红、瑞都脆霞和瑞都香玉聚在一起，而瑞都红玉为瑞都香玉的芽变，也聚为一类。紫珍珠和早玫瑰香亲本相同聚为一类。艳红、早玛瑙爱神玫瑰与香妃聚为一个大类，他们都有相同的的亲本玫瑰香。该聚类结果清楚的反应了品种之间亲缘关系的远近。

　　3　讨论

　　采用9 对S SR引物对1 3 个葡萄品种进行了分子身份证构建和亲缘关系分析。从平均等位基因数（5.3）、期望杂合度（0.435-0 . 8 11 ） 和引物多态性信息含量（0.401-0.784）方面，本实验结果都较低（表3）。Guo等利用相同引物在32个中国葡萄品种扩增平均位点数11.5，期望杂合度0.740-0 . 9 1 5 ， 多态性信息含量0 . 7 1 6 -0.908。本研究结果也低于Moreno-Sanz等采用相同引物在西班牙品种中的扩增结果。可能是由于13个供试葡萄品种来源于相同的育种单位，许多品种父母本相同，亲缘关系较近，选育品种的性状相似，导致品种遗传多样性较低。但是通过这9个分子标记，也可以将13个葡萄品种完全区分开。同时我们发现标记VrZAG79在本研究所用的13个中国葡萄品种中扩增等位基因数最多，多态信息含量最高，这与Guo等在32个中国葡萄品种的实验结果一致，表明VrZAG79可以作为区分中国葡萄品种的核心标记之一。

　　在引物扩增结果的基础上，我们采取最小等位基因编码法[13]对13个葡萄品种进行分子编码。得到了13个葡萄品种编码各异的分子身份证。在桃编码中发现亲缘关系较近的品种很难区分。而本研究中，对于亲缘关系较近的品种通过增加引物也得到了有效区分，如瑞都红玫和瑞都早红等。本研究中对来自同一育种单位亲缘关系相同或较近的品种均可被有效区分，充分说明我们所选的引物足以区分亲缘关系很近的不同材料，亦即利用SSR标记构建葡萄分子身份证具有较强的可靠性，可作为鉴别葡萄品种的一种有效方法。本试验得出的结果在一定程度上可以作为供试品种鉴定的依据，但在后期的大量鉴定中的适用性还需进一步的验证。如果能将分子标记和品种来源及表型性状相结合来研究制定它们的分子身份证将会有更加科学客观的试验结果。

　　4　结论

　　本研究采用国际通用的9对SSR引物，对13份中国葡萄优新品种进行了亲缘关系分析，构建了它们的有效分子身份证，再一次表明SSR分析技术可以作为葡萄品种分子身份证构建的有效技术手段。