中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心
董雅凤 范旭东 张尊平 任芳
由于缺乏有效的检测手段和健全的无病毒苗木繁育体系，我国葡萄病毒病进呈扩展蔓延趋势。为了有效控制葡萄病毒病的危害，推进葡萄无病毒栽培发展，我国颁布实施了农业行业标准《葡萄病毒检测技术规范》（NY/T 2377-2013）。
该标准规定了葡萄主要病毒检测技术的术语和定义、检测对象、检测方法和检测结果的判定，适用于葡萄接穗、插条、苗木、组培苗、田间植株中主要葡萄病毒的检测。
1 术语和定义
（1） 葡萄无性繁殖材料（grapevine asexual propagationmaterials）：用于嫁接繁殖葡萄苗木的接穗或扦插繁殖葡萄苗木的插条。
（2）葡萄苗木（gr apevinenursery stock）：采用品种接穗和砧木嫁接繁育的葡萄嫁接苗，以及通过扦插、组织培养等方法繁育的葡萄自根苗。
（3）葡萄组培苗（grapevinenursery stock from tissue culture）：指利用葡萄外殖体，在无菌和适宜的人工条件下，培育的完整植株。
（4） 指示植物（ i n d i c a t o rplant）：是指被某种或某类病毒侵染后，在适宜的环境条件下，能够表现典型症状的寄主植物。
（5） 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA）：在固相支持物上（酶联板）包被病毒特异性抗体，加入待测样品后，再用酶标记的病毒抗体进行免疫识别，最后通过酶与底物的颜色反应检测病毒是否存在的一种血清学检测方法。
（6）逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerasechain reaction, RT-PCR）：利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，再以此为模板并以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段）通过高温（DNA分子变性）和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。
2 检测对象
（1）葡萄扇叶病毒（Grapevinefanleaf virus，GFLV）
（2） 葡萄卷叶相关病毒1（Grapevine leafroll-associated virus 1，GLRaV-1）
（3） 葡萄卷叶相关病毒2（Grapevine leafroll-associated virus2，GLRaV-2）
（4） 葡萄卷叶相关病毒3（Grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）
（5） 葡萄卷叶相关病毒4（Grapevine leafroll-associated virus 4，GLRaV-4）
（6） 葡萄卷叶相关病毒5（Grapevine leafroll-associated virus 5，GLRaV-5）
（7） 葡萄卷叶相关病毒7（Grapevine leafroll-associated virus 7，GLRaV-7）
（8）葡萄病毒A（G r a p e v i nevirus A，GVA）
（9）葡萄病毒B（G r a p e v i n evirus B，GVB）
（1 0） 葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus，GFkV）
（1 1） 沙地葡萄茎痘病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associatedvirus, GRSPaV)
3 检测方法
（1）指示植物嫁接法
① 萄扇叶病毒、葡萄卷叶相关病毒、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用指示植物进行检测。
②采用绿枝嫁接和硬枝嫁接方法，将待检样品嫁接到指示植物，或将指示植物嫁接到待检样品上，每个组合重复3~5株。
③ 长季节定期观察指示植物的症状表现。
（2） 酶联免疫吸附法（ELISA）
①葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶相关病毒1, 2, 3, 5, 7、葡萄病毒A、葡萄病毒B和葡萄斑点病毒等能够获得稳定可靠抗血清的病毒，可采用ELISA方法进行检测。
②宜的检测时期和取样部位见附表1。
③具体检测程序见试剂盒使用说明。
（3）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
①葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶相关病毒1, 2, 3, 4, 5, 7、葡萄病毒A、葡萄病毒B、葡萄斑点病毒和沙地葡萄茎痘病毒均可采用RT-PCR方法进行检测。
②适宜的检测时期和取样部位见附表1。
③具体检测用引物见附表2。
4 检测结果判定
检测结果呈阳性，即判定该样品携带相应的病毒；检测结果呈阴性，应进行复检。如采用2种以上的检测方法，且检测结果不一致，则以阳性结果为准，判定该样品携带相应的病毒。对葡萄无病毒母本树和苗木进行检测时，应根据NY/T1843的要求进行。