虫害防控岗位
王琦 程玉琴
葡萄是世界上极为重要的果树作物，而葡萄卷叶病（Grapevineleafroll disease，GLD）是发生在葡萄上的最重要病毒病害之一。GLD症状表现常因葡萄品种、环境条件、发病时间及年份的不同而异。一般表现是葡萄植株叶片叶缘向下反卷，而且红色葡萄品种感病后叶肉在秋季正常变红之前就变红，白色葡萄品种感病后叶色则不变红，但叶肉变黄或叶缘的颜色变浅，叶脉有轻微褪绿。该病通常可导致葡萄减产30%~50%，果实中可溶性固形物含量下降约30%。至今已发现至少有5种葡萄卷叶伴随病毒（Grapevine leafrollas soc i a t ed vi rus，GLRaV），即GLRaV-1、-2、-3、-4、-7及GLRaV-4的变种GLRaV-5, -6, -9,-De, -Pr and -Car与该病相关。许多研究结果已表明GLRaV-3是与该病相关的最重要病原物。
GLRaV-3为长线形病毒科（Closteroviridae）卷叶病毒属（Ampelovirus）的典型成员，其基因组为正单链RNA。血清学以其快速、操作简便、成本低、适合批量样品检测等优点而被广泛应用于葡萄病毒检测中。但是血清学方法的灵敏度较低，同时GLRaVs为韧皮部特异性病毒，在植株中的分布不均，且病毒在植株体内的含量随季节变化较大，因此用血清学方法检测的结果重复性较差。逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR, RT-PCR）因其灵敏度高、特异性强、重复性好而成为检测GLRaVs的最常用方法。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA（complementary DNA）的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，其过程由两部分组成：以mRNA为模板，加入反转录引物（OligodT、随机六核苷酸引物或特异的下游引物）和dNTP，在逆转录酶的作用下，合成与mRNA互补的cDNA序列。然后以合成的cDNA为模板， 加入引物和dNTP， 在DNA聚合酶作用下进行PCR扩增。
GLRaVs的PCR检测引物通常根据病毒基因组中的相对保守蛋白基因序列如CP（coat protein）或Hsp70（70kDa-heat shock protein homolog）的保守区进行设计，反转录引物可用特异性引物，也可用随机六核苷酸引物。主要技术要点如下:
1 总RNA提取
取3-5个葡萄叶柄，用镊子剥下其外皮（韧皮部组织），混合后称取0.1~0.2g放入研钵中，加入液氮，将其研磨成粉末。将粉末转移到1.5mL离心管，按照试剂盒（EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒）的操作步骤提取总RNA。用微量紫外/可见分光光度计测定RNA浓度。
2 反转录
反转录试剂盒为PrimeScript®RT reagent Kit，TaKaRa公司产品。将下列组分加入1.5 mL 离心管，混匀：将离心管放在37℃ 恒温水槽中1 小时（h）后获得cDNA。
3 PCR扩增
反转录后即进行 P C R 扩增。GLRaV- 3 检测引物（ 根据GLRaV-3 Hsp70蛋白基因序列设计，正向引物GLR3-F：5'-AAGTGCTCTAGTTAAGGTCAGGAGTGA-3'，反向引物GLR3-R：5'-GTATTGGACTACCTTTCGGGAAAAT- 3 ' ；浓度为2 0μM） 。用该引物检测出的目的条带大小为254bp。PCR反应体系包括下列组分：
混匀后将离心管放在PCR仪进行反应。PCR 反应条件：95℃ 预变性 5min；95℃ 变性 30s，57.0℃退火 30s，72℃ 延伸30s，40个循环；72℃ 延伸 10min。反应结束后取出。
4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
（1） 制备琼脂糖凝胶溶液（浓度为1.0%）：
称取琼脂糖0 . 2 g 放入三角瓶中， 将5 0 ×TAE 电泳缓冲液（2M Tris-醋酸，100mM EDTA；配制100mL：Tris 24.2g，0.5MEDTA( pH8 . 0 ) 1 0mL，冰乙酸5.7mL，去离子水定容到100mL）稀释50倍，然后将1×TAE电泳缓冲液20mL加到盛有琼脂糖 三角瓶中，盖上封口膜，振荡后置微波炉中将琼脂糖充分融化，取出后加入适量GoldViewTM核酸染料（每100mL凝胶中加入2~5 μL核酸染料）并轻摇混匀。
（2）凝胶的制备：将凝胶板置于制胶架中，插上加样梳，待胶溶液冷却至50℃左右时，轻轻倒入凝胶板上，除掉气泡。待凝胶冷却凝固后，垂直轻轻拔出梳子后将凝胶放入电泳槽内，加入1×TAE电泳缓冲液，使电泳缓冲液的液面略高出琼脂糖凝胶面。
（3） 加样： 在薄膜上混合PCR产物（5μL，约0.5~1μg）和上样缓冲液（1μL）。用微量移液器分别将样品和DNA Marker加入琼脂糖凝胶的加样孔内，每加完一个样品，应更换一个Tip头，以防污染，加样时勿碰坏加样孔周围的凝胶。注意：加样前要先记下加样的顺序。
（4）电泳：加样后，将电泳槽立即通电进行电泳，调节到合适电压（5 V/cm）。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1 cm处时，停止电泳。
（5） 观察和拍照： 电泳完毕，取出凝胶。在凝胶成像仪下观察是否出现目的条带（约254 bp）并拍照。