寒区品种选育岗位

郭修武 李坤 王博 郭印山 刘镇东 李成祥

 

　　化感作用是指一种植物或微生物（供体）向环境释放某些化学物质而影响其他有机体包括植物、微生物和动物（受体）的生长和发育的化学生态学现象，包括促进和抑制两方面作用。当受体和供体属于同种或同科植物时产生抑制作用的现象，称为植物的自毒作用。自毒作用是植物种内相互影响的方式之一。化感物质主要通过地上部淋溶挥发、根系分泌、植株残体的分解等途径进入到环境中，其中根系分泌是自毒物质的主要来源之一。

 

　　葡萄是主要的果树经济作物，但随着栽培年限的增加，果园出现严重的连作障碍，主要表现为树势衰弱、产量降低和病虫害严重的现象，植物自毒作用作为连作障碍的主要原因之一，现已经成为国内外专家争相研究的焦点。本试验采用组培苗试验的方式筛选根系分泌物中对葡萄生长发育影响最大组分，分析其中的物质，并通过组培苗试验与田间试验相结合的方式对待测组分中的物质进行验证，以期筛选出葡萄的主效自毒物质，为进一步揭示葡萄连作障碍发生原因提供理论依据。

 

　　1　材料与方法

 

　（1）试验材料

 

　　试验在沈阳农业大学葡萄试验园进行。供试盆栽苗为‘贝达’葡萄扦插苗，供试组培苗为‘山河二号’葡萄继代苗。

 

　　（2）根系分泌物的收集与处理

 

　　7月中旬选长势一致的‘ 贝达’葡萄盆栽苗40株，将其小心从土壤中挖出，洗净根系，放入装有1 L蒸馏水的小桶中。每桶8株，增氧机每隔15min通气15min，根系避光。经1d的适应培养后收集根系分泌物。每5h收集一次，连续收集3d。将收集的根系分泌物混合定容，过滤，在40 ℃下减压浓缩至50mL。

 

　　浓缩后的根系分泌物分别用正己烷（A1）、三氯甲烷（A2）、乙酸乙酯（A3）和正丁醇（A3）萃取3次后，将萃取液合并。各萃取相经旋转蒸发仪蒸发至干，溶于2ml蒸馏水中，备用。

 

　　（3） 根系分泌物中主效自毒组分的筛选

 

　　自毒作用的检测品种为‘山河二号’葡萄组培苗，在39mL MS培养基中加入1mL（过0.22μm的滤膜）上述不同萃取组分的根系分泌物，每处理3瓶，每瓶2株，以加入蒸馏水为对照。培养40d后进行各项指标的检测。化感作用效应敏感指数（RI）采用Williamson的方法进行分析：

 

　　RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T＜C)其中，RI表示化感效应，即参试因子的生物学效应的大小，C表示对照值，T表示处理值。当0＜RI＜ 1 时， 化感物质具有促进的作用，当-1＜RI＜0时，化感物质具有抑制作用，RI绝对值大小与作用强度成正比。

 

　（4）根系分泌物中自毒物质的鉴定

 

　　采用气质联用技术（ G C -MS ） 测定， 检测条件： 安捷伦5973N气质联用仪HP-5ms毛细管柱（30m×250um×0.25um），进样口为温度2 2 0 ℃ ， 接口温度为285℃，色谱柱温度50℃持续40min，然后以6℃/min 的速度升温至250℃ ，250℃持续15min ，载气为He气，EI源：70ev ，扫描范围m/z：35-600 amu，离子源：230℃，四级杆温度为150℃。

 

　　（5）主效自毒物质的组培苗验证

 

　　以‘山河二号’葡萄组培苗为试材，根据GC-MS鉴定结果选择六甲基-环氧三硅烷为参试物质，配置成0.05mmol/L、0.5mmol/L和5mmol/L的溶液。在39mL MS培养基中加入1mL（过0.22μm的滤膜）上述不同浓度的溶液，每处理3瓶，每瓶一株，以加入蒸馏水为对照，培养40d后进行各项指标的检测。

 

　　2　试验结果

 

　　（1）根系分泌物不同萃取组分对葡萄组培苗生长的影响不同萃取组分对葡萄组培苗地上部的生长发育影响不同（表1）。A1和A2组分抑制组培苗地上部分的生长，其地上鲜重和株高与对照相比分别降低了21.25%和9.9%，其中A2处理葡萄株高与对照存在显著差异。A3和A4组分显著促进组培苗地上部的生长，其中A3的促进作用强于A4，其地上鲜重和株高与对照相比分别增长了98.94%和16.67%，。从表1中还可以看出，与对照相比，不同萃取组分对组培苗地下鲜重和平均根长的影响不存在显著差异。

 

　　（2）不同萃取组分的综合化感效应指数

 

　　通过分析葡萄根系分泌物对组培苗综合化感指数的影响（图1），发现A1、A2、A3起抑制作用，其中A2，抑制作用最强，其综合化感效应指数为－0.9979＜0，而A4综合化感效应指数为0.066＞0，表现为促进作用。

 

 

　　（3）根系分泌物中主效自毒物质的分离鉴定

 

　　将自毒作用最强的组分即三氯甲烷萃取相分进行GC-MC分析，结果见表2.从表2可知，葡萄根系分泌物三氯甲烷萃取相经气质联用分析，共有效命名了15种物质。它们分属于烃类、酰胺类、苯类、吲哚类、芴酮类和吲嗪类，其中烃类的种类和相对百分含量较多。本试验将六甲基-环氧三硅烷作为参试主效自毒物质进行验证试验。

 

　　（4）主效自毒物质的组培苗验证

 

　　不同浓度六甲基-环氧三硅烷处理对葡萄组培苗的生长均有抑制作用（表3），具体表现为地上鲜重、地下鲜重、植株高度和平均根长的降低。但在浓度为0.05mmol/L和0.5m mol/L时抑制作用不明显，当浓度提高到5mmol/L时抑制作用增强，组培苗出现不生长、不生根的现象，有的甚至干枯死亡。

 

 

　　根系分泌物种类繁多且大部分物质为有机物质，分离难度大。在众多分离方法中因萃取法操作简单方便，而被广泛应用。本试验采用正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇四种不同极性溶剂对葡萄根系分泌物进行萃取，结果表明三氯甲烷组分的抑制作用最强。经GC-MS技术分析得出该组分主要包括：烃类、酰胺类、苯类、吲哚类、芴酮类和吲嗪类，其中烃类的种类和相对百分含量都最高。从烷类中选取六甲基-环氧三硅烷作为参试物质，结果表明，该物质对葡萄组培苗和均存在抑制作用，且处理浓度越高，抑制作用越强。

 

　　3　小结

 

　　（1）萃取技术可以有效地分离根系分泌物成分： 根据葡萄根系分泌物成分的极性差异，采用不同极性的溶剂对葡萄根系分泌物进行萃取，可以有效的将根系分泌物按照极性大小分成不同组分。

 

　　（2） 气质联用技术（GC -MS）是目前鉴定根系分泌物成分的有效方法：目前分离鉴定根系分泌物成分可以采用气质联用技术和液质联用技术两种方法，但液质联用技术因没有数据库参考，很难对分离成分进行鉴定。而气质联用技术配用有机物质数据库，可以根据物质的匹配度有效快速地鉴定出未知成分。

 

　　（3）组培苗验证是快速筛选葡萄根系分泌物自毒物质的有效方法：葡萄遗传上杂合程度高，后代分离严重，不能采用实生苗作为自毒作用生物检测的受体材料；而扦插苗个体又较大，生物检测反应较迟缓，故理想的检测材料为葡萄组培苗。但整个操作过程需要无菌条件，实验操作技术要求较高。